分子生物学-资料.ppt

(2) 平端或钝端 (blunt ends) 4. 异源同工酶 (Isoschizomer) 来源于不同细菌但具有相同识别序列的限制性内切酶为异源同工酶。 识别序列和酶切位点均相同的限制性内切酶; 识别序列相同但酶切位点不同的限制性内切酶 酶活性单位 在 37?C (某些限制性内切酶在 25?C 或 50?C) 条件下，每小时酶切 1 ?g DNA 所用的酶量为１个单位 (Unit)。 限制性内切酶缓冲液 NaCl, KCl: 提供正确的离子强度 Tris-HCl: 提供合适的 pH 环境 Mg2+: 限制性内切酶的辅助因子 DTT: 还原剂 BSA: 保护限制性内切酶 5. 类型 II 限制性内切酶的反应条件 限制性内切酶缓冲液 (Fermentas 公司) 限制性内切酶及其缓冲液 (Fermentas 公司) 星活性 (star activity, * activity) 某些限制性内切酶在非最适反应条件时，酶的专一性发生改变。 原因： 酶浓度过高，甘油浓度过高； 缓冲液的 pH 值过高； 缓冲液的离子强度过低； 有机溶剂存在 5’GAATTC 3’ 3’CTTAAG 5’ EcoRI 5’ AATT 3’ 3’ TTAA 5’ EcoRI* 酶的专一性改变 (1) 用一种限制性内切酶酶切 DNA 分子时，应使用其最佳缓 冲液，给限制性内切酶提供最佳的 pH 和离子浓度。 (2) 需用两种限制性内切酶酶切 (双酶切) 同一 DNA 分子时， 应注意缓冲液的选择 ? 两种限制性内切酶使用相同的缓冲液时，这两种限制性内切酶的活 性均为 100％。 ? 两种限制性内切酶使用相同的缓冲液，但其中一种限制性内切酶的 活性低于 100％，而必须达到 75％。 ? 两种限制性内切酶使用不同的缓冲液，先用限制性内切酶 1 (缓冲液 1) 酶切 DNA 分子，纯化酶切反应，将 DNA 溶解在缓冲液 2 中， 用限制性内切酶 2 酶切同一 DNA 分子。 酶切反应小结 T4 DNA 连接酶 (T4 DNA ligase) 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase) DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow) T4 DNA 聚合酶 (T4 DNA polymerase) T7 DNA 聚合酶 (T7 DNA polymerase) Taq DNA 聚合酶 (Taq DNA polymerase) 等热稳定 DNA 聚合酶 逆转录酶 (Reverse transcriptase) 末端脱氧多核苷酸转移酶 (Terminal deoxynucleotidyl transferase) 多核苷酸激酶 (Polynucleotide kinase) DNA 核酸酶 I (DNA nuclease I) S1 核酸酶 (S1 nuclease) 外切核酸酶 III (Exonuclease III) ? 外切核酸酶 (? Exonuclease) 二、修饰酶 (modifying enzymes) T4 DNA 连接酶, ATP TGCTTAA 5’ - 3’ - ACG -OH 3’ -P 5’ AATTCGT GCA - 3’ - 5’ 5’ P - 3’ OH - TGCTTAA 5’ - 3’ - ACG AATTCGT GCA - 3’ - 5’ (一) T4 DNA 连接酶 (T4 DNA ligase) 催化两个 DNA 分子的 3’-OH 和 5’-P 之间形成磷酸二酯键。 连接带粘性末端的两个 DNA 分子 T4 DNA连接酶, ATP ACG 5’ - 3’ - TGC -OH 3’ -P 5’ TAGCCGT ATCGGCA - 3’ - 5’ 5’ P - 3’ OH - 5’ - 3’ - TGCTAGCCGT ACGATCGGCA - 3’ - 5’ 连接带平端的两个 DNA 分子 粘性末端 平端 (二) 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase) 使 DNA，RNA，rNTP 和 dNTP 的 5’ 末端 (5’-P) 去磷酸化。 (三) E. coli DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段 Klenow 片段是 E. coli DNA 聚合酶 I 的羧基端片段，长度为全酶的 70％；具有 5’ ? 3’ 聚合酶活性及 3’ ? 5’