第十六章定量分析中常用的分离方法资料.ppt

上样 加压法是采用打气入柱的方式进行加压，可用一个装有样品的分液漏斗与柱用橡皮塞连接，分液漏斗上端串有压力剂并经缓冲瓶与打气管相连，当达到所需压力时就将打气管夹紧。减压法是在柱的排出口增设抽气装置，工业上多采用此法。 3.洗脱 分离不同的物质选用不同的洗脱剂。原则是用一种更活泼的离子把交换在树脂上的物质再交换出来。 常用的洗脱剂为酸类、碱类或盐类溶液，改变整个系统的酸碱度和离子强度，以使交换物质的交换性能发生变化，己交换上的物质就逐渐被洗脱下来。 为了提高分辨率，常采用梯度洗脱法。 5.4 凝胶色谱法 凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种分离技术，又称之凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。 优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。 缺点：分离速度较慢。 一、基本原理 小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散， 小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品分子按从大到小的顺序先后流出色谱柱。这种现象叫分子筛效应。 凝胶过滤层析过程示意图 小分子 大分子 凝胶基质 凝胶珠 二、凝胶过滤介质 理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。 目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。 凝胶分类 （1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等 极性溶剂。 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。 1. 葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国外商品名为Sephadex。由葡聚糖交联而得。 2. 琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联的。它与葡聚糖不同，孔隙度是以改变琼脂糖浓度而达到的。 琼脂糖凝胶的化学稳定性不如葡聚糖凝胶。 用琼脂糖凝胶进行分离操作的适宜工作条件是在pH为4.5～9，温度0～40 ℃。 琼脂糖凝胶对硼酸盐有吸附作用，不能用硼酸缓冲液。 3.聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的。 其稳定性比葡聚糖凝胶好。洗脱时不会有凝胶物质被洗脱下来。在pH2~11范围稳定。 缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。 4.疏水性凝胶 常用的疏水凝胶为聚甲基丙烯酸酯凝胶或以二乙烯苯为交联剂的聚苯乙烯(如Styrogel Bio-Beads-S)凝胶。“Styrogel”商品有11种型号，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好。 5. 多孔玻璃珠 多孔玻璃珠的化学和物理稳定性好，机械强度高，不但抵御酶及微生物的作用，还能够耐受高温灭菌和较强烈的反应条件。 缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。 6. 其他载体 由聚丙烯酰胺和琼脂糖混合组成的载体已投入应用。它的特点是载体既有羟基又有酰胺基，并且都能单独与配基使用。但这类载体不能接触强碱，为了避免酰胺水解，使用温度不能超过40 ℃。 三、凝胶过滤介质的选择 1. 分离范围 2. 分辨率 3. 稳定性 四、操作方法 1. 凝胶的预处理 市售凝胶必须经过充分溶涨后才能使用，如果溶涨不充分，则装柱后凝胶继续溶涨，造成填充层不均匀，影响分离效果。在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液，搅拌、静置、倾去上层混悬液、除去过细的粒子。如此反复多次，直至上层澄清为止。 2. 层析柱的选择 层析柱的体积和高径比与层析分离效果的关系相当密切。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞。 3. 凝胶柱的装填 空柱中应留1/5的水或溶剂。所用凝胶必须是经过充分溶涨的。开始进胶后应当打开柱端阀门并保持一定流速，太快的流速往往造成凝胶板结，对分离不利。进胶过程必须连续、均匀，不要中断，并在不断搅拌下使胶均匀沉降。为此，层析柱要始终保持垂直。凝