分子生物学课件第五章：基因表达调控真核生物资料.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNA识别结合域： 锌指（zinc finger）结构 A．Cys2／His2锌指结构； B．折叠的Cys2／His2锌指结构； C．Cys2／Cys2锌指结构 同源结构域（homeodomain，HD） 同源盒基因家族各基因间具有一相同的保守序列。所含的至少二个α螺旋中形成“转折”，第三个α螺旋与DNA大沟相互作用，是同源盒蛋白与DNA结合的主要力量 。 碱性-亮氨酸拉链 亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链” 。 肽链氨基端20～30个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合。 DNA结合部位结构域 疏水性 亲水性 亲水性 螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH） 含两个双性α-螺旋，每3～4个氨基酸含一个疏水性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个能阻断螺旋的氨基酸残基。 ①酸性α-螺旋（acidic α-helix domain） 能非特异性地与起始复合物（如TATA盒结合因子）相互作用发挥转录活化功能。 ②富含谷氨酰胺的结构域（glutamine-rich domain） 最强的转录活化域之一。 ③富含脯氨酸结构域（proline-rich domain） 2)转录活化结构域 （transcriptional activation domain） 3.转录水平的调控机制 (１)反式作用因子的活性调节 真核基因转录起始的调节，首先表现为反式作用因子的功能调节，即特定的反式作用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。 反式作用因子的激活方式: ①表达式调节 ②共价修饰 A.磷酸化－去磷酸化。 B.糖基化。 ③配体结合 ：(核受体超家族) ④蛋白质与蛋白质相互作用 （2）反式作用因子作用方式 1）成环（looping） 2）扭曲(twisting) 3）滑动(sliding) 4）Oozing  反式作用因子与顺式元件结合如何影响到远距离RNA聚合酶结合并影响其调控基因？ （3）反式作用因子的组合式调控 基因表达的调控不是由单一的反式作用因子完成而是几种因子组合，发挥特定的作用。 1 （1）报道基因分析法 原理：将调控序列克隆到含有报道基因的表达质粒中,再转染细胞,通过报道基因的活性可检测转录活性。 应用：启动子活性的检测 常用的报道基因：Luciferase （荧光素酶）、 GFP（绿色荧光蛋白）、 SEAP（分泌性碱性磷酸酶） 4.转录水平研究方法 1 （2）DNaseⅠ超敏感分析法 原理：转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加，经DNaseⅠ消化常出现长短不均一的100－200 bp 的DNA片段，说明此 DNA 受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNaseⅠ高敏感点(hypersensitive site)。 方法：用 DNaseⅠ处理细胞核DNA，再用合适的内切酶进行消化，电泳分离，转膜，用靶基因的探针进行southern 杂交，根据片段大小推测基因调控区的位置。 应用：确定基因启动子内调控区的位置。 1 （3）足纹法（foot printing) 原理：蛋白质结合到DNA序列上，可阻止核酸酶对其的降解。 方法：DNA序列与靶蛋白进行孵育，再用DNaseⅠ进行切割，电泳，分析图谱。 应用：确定DNA结合蛋白的识别序列。 1 （4）凝胶迁移率（gel shift assay) 或电泳迁移率实验（EMSA） 原理：蛋白质与特定的DNA序列结合后，迁移率会发生改变， DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。 方法：纯化的蛋白或细胞粗提液和同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，聚丙烯凝胶电泳，放射自显影。 应用：研究DNA结合蛋白；RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 (三)转录后水平的调控 1. 5ˊ端加帽和3ˊ端多聚腺苷酸化及意义 5ˊ端加帽:真核生物转录生成的mRNA在转录后，在5ˊ端加上7－甲基鸟苷 (m7GPPPmNp-)。 意义:保护转录体mRNA不受5ˊ外切酶降解，增强mRNA稳定性，有利于mRNA从细胞核向胞质转运，促进mRNA与核糖体结合（通过帽结合蛋白介导完成）。 3ˊ端加尾:转录后在mRNA在3ˊ末端加上50～150个腺苷酸，即poly(A)尾。 意义:保证mRNA在转录过程中不被降解。 2. mRNA前体的选择性剪接(alternative splicing)对基因表达的调控作用 （1）m