基因诊断和基因治疗-资料.pptVIP

腺相关病毒(AVV ) 一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需 要其他基因才能复制。 结构： rep基因－－编码病毒的复制、整合功能所需蛋白 cap基因－－编码病毒结构组分 ITRs序列－－反向末端重复，定义基因的开始和 结束，制约DNA序列大小，包裹入 衣壳。 细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。 骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞 选择原则: 1、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输 回体内。 2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年， 至病人的整个生命。 3、易于受外源遗传物质的转化。 4、在选用病毒载体时，目的基因具表达最好具有组织特异 性的细胞 3、选择靶细胞 （禁止使用生殖细胞，只能用体细胞） 1、骨髓细胞：最被重视和常用的靶细胞。 常用细胞： 优点：⑴易接受各种处理、⑵已积累丰富经验，⑶多数遗传疾病 涉及骨髓细胞、⑷源自骨髓的细胞遍布全身。 缺点： -骨髓干细胞含量少（占骨髓细胞0.1%） -治疗基因在核骨髓细胞表达时间短（几个月）。 -只有部分干细胞有活性 -造血干细胞分化可能导致基因失活。 -有些遗传疾病与骨髓干细胞无关。 2、肝细胞：是许多遗传代谢缺陷的靶细胞。 3、皮肤细胞：易于繁殖及转化。 4、淋巴细胞：易采集、分离，大量繁殖，连续 多次输入 5、癌细胞：肿瘤治疗常用细胞。 方法： 1、物理法： 显微注射法 电穿孔法 基因枪技术 2、化学法： 磷酸钙沉淀法 DEAE-葡萄糖法 脂质体法 3、融合法 4、病毒感染法 4、基因的转移 转染细胞后的筛选： 方法： 1、标记基因筛选法： 2、基因缺陷型受体细胞的选择性 3、基因共转染技术 4、分子生物学方法: 原位杂交 Southern杂交 斑点杂交 目的基因或标记基因作为探针。 方法： （目的基因和标记基因的表达） 原位杂交、 Nouthern杂交、 RNA点杂交 （检测mRNA的转录） 免疫组化染色（检测基因翻译出的蛋白质) 5、外源基因表达的检测： 6、回输体内 将治疗性基因修饰的细胞通过不同方式回输 入体内，以发挥治疗效果。 如： -淋巴细胞经静脉回输入血 -造血细胞经自体骨髓移植 - 皮肤成纤维细胞经胶原包裹后埋入皮下组织 1、肝专一性表达： 磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶启动子 2、肌肉专一性表达：肌苷激酶的调控片段 3、乳腺专一性表达： β酪蛋白，乳清酸蛋白 4、黑色素专一性表达: 酪氨酸和酪氨酸相关蛋白（TRP) 5、胶质瘤专一性表达：鞘磷酸碱性蛋白基因上游片段 6、肺癌专一性表达： 人表面活性蛋白A 与目的基因一起重组入反转录病毒，用于基因靶向表达。 组织专一性表达的调节片段: 基因治疗的应用及展望 应用治疗： 遗传病（学友病、囊性纤维病、家族性高血压 恶性肿瘤 心血管疾病 感染性疾病（AIDS、类风湿等） 呈待解决的问题： 外源基因表达效率 外源基因表达调控 遗传性疾病面临的免疫问题 反转录病毒载体随机插入的外源基因，若插入不当，可能破坏另一个基因的表达或激活其它基因（潜在的危险）。 使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100 到1000 倍加入到第二轮扩增中进行15 到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30 到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。 巢式PCR 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * AF