发光法检测食品微生物资料.ppt

发光法检测食品中微生物 讲解人：赵亚丽 生物发光 ATP 法微生物检测介绍 ATP 生物发光法检测的原理 ATP 生物发光法的检测步骤 ATP 生物发光法的特点 ATP 生物发光法的应用 发光生物 真菌、甲虫、蠕虫、海星，等等，还有我们最熟悉的萤火虫 海洋中有好几千种发光生物。深夜，在海中游泳或岸边漫步时，都会看到海上的“磷光”现象。 多年前，科学家已经将生物萤光应用到生命科学领域。与化学荧光（fluorescence）相比，生物萤光（bioluminescence）更灵敏、更可信、效果更好。 多数海洋生物都靠荧光素——荧光素酶系统发光。不同的荧光素——荧光素酶反应产生不同的光。有一些动物虽然自己不闪光，但把荧光素和荧光素酶分泌入水中，让它们相互作用，产生光雾，掩护自己逃走。 一、生物发光 ATP 法微生物检测 在食品微生物生物发光检测方面，主要的方法为 ATP 酶法。20 世纪 80 年代，英国人首先研制出ATP 检测仪（检测系统）。1983年，Moyer 等最早提出细胞内源性 ATP 的含量可以反映细胞的活性和活细胞的数量。同年 Gronroos 等也证实该技术是一种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检测方法。目前，这一技术已经应用于各项食品产业，包括生乳生菌数估算[Giese, 1997]、果汁产业的菌数估算[Graumlich, 1985]等。 由于在活细胞中 ATP 含量近乎是恒定的，所以通过检测 ATP，可以间接地证明生物体的存在。生物发光法无需培养过程，操作简便、灵敏度高，整个过程仅为十几分钟，具有其他微生物检测方法无可比拟的优势。 。 ATP理化性质 ATP(adenosine triphosphate， 三磷酸腺苷) 是高能磷酸化合物的典型代表。ATP 是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的核苷酸，其分子结构式如图 1 所示。ATP是细胞内特殊的自由能载体，广泛地存在于细胞内，如细胞核、细胞溶胶、线粒体等。易水解，且水解时可释放出大量的能量，但水解易受细胞内环境的 pH 、Mg2+浓度等的影响。ATP 在生命活动中起着传递能量的作用。 二、ATP 生物发光法检测的原理 ATP 普遍存在于所有活的生物体中，被用来贮存和传递化学能，称作为“能量货币”。当生物体死亡后，在细胞内酶的作用下，ATP 很快被分解掉。因此，测定样品中的 ATP 浓度，即可推算出活菌数。 McElroy最先引入“荧光素酶---ATP” 检测法，其反应机理为：在Mg2+存在下， 荧光素酶(firefly luciferase)以 D-荧光素酶、ATP 、O 2 为底物，将化学能转化为光能。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。 三、ATP 生物发光法的检测步骤 ATP 生物发光法的检测步骤大体包括：取样、样品 ATP 的萃取、添加‘荧光素-荧光素酶’、测定生物发光量、求出 ATP 浓度和活菌数。 通常，样品未经处理是不能测定 ATP 的。测定时需先将样品与 ATP 提取剂混合，使细胞膜和细胞壁溶解，释放出 ATP 。ATP 提取剂是以表面活性剂为基质的专用试剂。然后，提取出的 ATP 再与‘荧光素-荧光素酶’生物发光剂作用，用发光检测仪测定 ATP 与发光剂反应的生物发光量。通过预先测定的 ATP 标准曲线，得出活菌的总 ATP 量，即可得出细菌总数。ATP生物发光法检测微生物，需要先将微生物体内的ATP提取出来，测量其发光值，对照由标准ATP试剂测量所得发光值和ATP的浓度标准曲线，根据发光值得到ATP的浓度，最后转化为微生物的浓度。 四、ATP 生物发光法的特点 A TP 生物发光法的优点主要是快速、简便、重现性好；而由于其要求样品中细菌浓度最低不少于1000 个 /ml ，使得灵敏度有时达不到卫生学要求。此外，ATP 生物发光法不能区分微生物 ATP 与非微生物ATP ；并且由于食品本身、ATP 提取剂等含有离子，某些离子又会对 ATP 的测定造成干扰、抑制发光作用等使ATP发光法的精确度受到限制。 五、ATP 生物发光法的应用 ATP 生物发光法的应用范围十分广泛，现已应用于食品工业的众多领域。例如，用生物发光法测定肉类食品中细菌污染情况。研究表明，ATP 生物发光法与标准的细菌培养菌落计数法相比，二者具有良好的相关性。此外，ATP 生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的测定、啤酒中菌落总数测定、调味品及脱水蔬菜的细菌学测定等。实验表明，ATP 生物发光法与传统的琼脂平板法均具有高度的相关性。 谢谢！ 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤