原位杂交NorthernBlotting资料.ppt

* 1962, after Rosalind Franklins death, Watson, Crick, and Wilkins are awarded the Nobel Prize, giving no credit to Franklin for her invaluable work. * DNA的变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。断裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。DNA变性不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。 * * cDNA 探针是目前应用最为广泛的一种探针。 DNA探针（包括cDNA探针）的优点： 　　①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。 　　②不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 　　③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。 * 若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选和点突变分析。 筛选寡核苷酸针的原则 ： 　　①长18～50bp，较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。 　　②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。 　　③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 　　④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。 　　⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。  * 半抗原 hapten 能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。 * 硅化载玻片是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片或细胞牢固的贴于玻璃片上，防止抗原修复过程中由于高温、高压的诸多因素所造成的脱片现象。 玻片经过硅化处理后具有束水性。 简单操作是先配制2％二甲基二氯硅烷（dimethyl dichlorosilane, DMDC）（DMDC 2ml, 三氯乙烷98 mL, 按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用)。经过洗净的玻璃片插入2%的DMDC 溶液中，使其均匀地涂上2%DMDC， 40℃烤干，再用锡箔纸包裹，于180－250℃烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。 也有用2% 氨丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane，APES)丙酮液处理。 * 双链DNA探针和靶DNA变性 微波高火状态煮30 分钟，自然冷却2-3 分钟。 * 非放射性标记系统主要包括三大类：半抗原类、荧光色素类、酶类。其中半抗原类使用最为广泛，商品化选择最多。 半抗原类主要有生物素(biotin)、地高辛、二硝基苯(dinitrophenyl)、雌二醇等，前两者使用最为广泛，且均有商品化试剂盒选用。 半抗原 　　hapten 　　能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。 1.生物素系统工作原理是 将生物素化的( d )UTP掺人探针后，加人酶(AP/HRP)联亲和素(avidin/streptavidin)，利用生物素与亲和素之间存在特异亲和力使亲和素与探针结台；而后加入该酶的显色或发光底物显示结果.然而,生物素系统存在一个较大的缺陷，即生物素是一种维生素分子，它普遍存在于各种细胞中,因而在原位杂交时内源性背景大。 地高辛是一种类固醇半抗原化合物，化学名为异羟基洋地黄毒甙，来源于植物毛花洋地黄。自1988年由德国宝灵曼将其开发为非放标记系统。与生物素相比较，它不存在于一般生物体中，因而消除了内源性背景的问题。并且有报导表明，在原位杂交中，地高辛系统标记效率更高，达到每20碱基带有一个地高辛配基，且杂交后又有灵敏的酶免疫检测体系，因而其灵敏度在原位(膜)杂交中10倍于生物素系统。地高辛现已成为使用最广的非放射性标记物，尤其在原位杂交中已基本取代生物素系统，是迄今为止较为完善的一种非放射性标记系统。 2. 荧光色素类 荧光色素类主要包括荧光素、异硫氰酸荧光素、香