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选修1 生物技术实践--微生物的利用 一．微生物实验室培养 1．培养基 1.1概念 按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。固体（加凝固剂琼脂）、液体。 1.2成分 水、无机盐、碳源（有机、无机碳源）、氮源（有机、无机氮源）、生长因子（维生素）。 例如：牛肉膏蛋白胨培养基成分： 牛肉膏（碳源、磷酸盐、维生素）、蛋白胨（氮源、维生素）、NaCl（无机盐）、H2O（H、O元素）。 1.3满足条件 PH：霉菌（酸性）、细菌（中性、微碱性） O2：醋酸菌（需氧）、乳酸菌（厌氧） 特殊物质：乳酸菌需要加入维生素 2．牛肉膏蛋白胨培养基制备 计算---称量---溶化---灭菌---倒平板（培养基50℃时倒平板、冷凝后，平板倒置---水分挥发、防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。） 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。 1.以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述错误的是（ A ） A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯 C．待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板 D．待平板冷却凝固约5～10 min后将平板倒过来放置 解析：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。待培养基冷却至50℃，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态。平板冷却几分钟后还需倒置。 3．纯化大肠杆菌 接种方法：平板划线、稀释涂布平板法等。核心：---防止杂菌污染。 3.1 平板划线法 ①每次划线前和结束都要灼烧接种环 ②灼烧后等冷却进行划线 ③从上次划线末端开始划线 ④在火焰旁接种划线 3.2 稀释涂布平板法 （1）系列稀释操作 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释的菌液进行一系列的梯度稀释。 （2）涂布平板 将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。 注意：酒精灯与培养皿距离合适，吸管头不要接触任何其他物体，吸管要在酒精灯火眼周围等。 二．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.土壤取样、选择培养基 组别 培养基类型 是否涂布接种 目 的 实验组 以尿素为唯一氮源的选择性培养基 是 分离尿素细菌 对照组 牛肉膏蛋白胨培养基 是 用以判断选择性培养基是否具有选择性（菌落数应多于实验组） 对照组 以尿素为唯一氮源的选择性培养基 否 统计在操作过程中，空气中可能存在的落在培养基上的尿素细菌的数目 2.统计菌落数目 ①计数： 选择长有30~300个菌落的平板计数，同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。 ②计算： 每样品中的菌株数=（同一稀释度三次重复的菌落平均数÷涂布平板时所用稀释液的体积）×稀释倍数 ③鉴定分解尿素的细菌 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红。 注意： 分离不同的微生物要采用不同的稀释度，测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同。 2.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4.7H2O 0.2g 葡萄糖 10g 尿素 1g 琼脂 15g 将上述物质溶解后，用自来水定容到1000ml 尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如表所示，实验步骤如下。请分析回答问题： （1）这种培养基属于选择培养基。该培养基能否用于植物组织培养？不能 ，理由是缺少植物激素（缺少植物生长需要的各种营养）。 （2）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素 和葡萄糖 ，实验需要振荡培养，原因是为目的菌提供氧气。 （3）转为固体培养时，常采用稀释涂布平板法（平板划线法）的方法接种，获得单菌落后继续筛选。 （4）在进行分离分解尿素的细菌实验时，A同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有：土壤取样不同、培养基有污染（操作方法失误） （5）简述土壤中可分解尿素细菌的鉴定方法及原理： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 ，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，PH增高，使酚红指示剂变红色 （6）实验结束后，使用过的培养基应该进行