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高效液相色谱法（HPLC） 第五组 顾慧君 许梦伶 邰九锦 管振雪 练国峰 吉喆 * 分离原理 色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。 S—固定相 X—组分 XS—固定相中组分分子 Xm—流动相中组分子 m—流动相 Y—溶剂分子 YS—固定相中溶剂 Ym—流动相中溶剂分子 * * 仪器基本结构 * 高效液相色谱仪 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 1、储液器 2、高压输液泵 3、过滤器 4、梯度洗脱装置 1、六通阀进样器 2、 自动进样器 ----色谱柱、色谱柱恒温装置 1、通用型检测器（常用：紫外可见检测器） 2、专用型检测器 * 高效液相色谱分析方法建立的一般步骤： 1、了解样品的基本情况 2、明确分离目的 3、了解样品的性质和需要的预处理 4、检测器的选择 5、分离模式的选择 6、固定相和流动相的选择 * 种 类 特 点 应 用 表孔硅胶（薄壳硅胶） 出峰快，柱效较高。 表面积小，样品容量小，峰易拖尾。 适用于极性范围较宽的混合样品的分析。 全多孔硅胶 表面积大，柱效高。 应用最广泛的固定相，适用于极性化合物的分离。 固定相 （1）固定相的种类——固定相粒径10μm (2）固定相的选择依据—分析样品的性质，吸附剂的形状、粒度、比表面积等。 （3）对试样的保留时间顺序 醛≈酮 醇≈胺 砜 亚砜 酰胺 羧酸 * 流动相 溶剂与固定相互不相溶，保持色谱柱的稳定性。 纯度高，以免微量杂质在色谱柱中积累，引起柱性能改变。 溶剂性能与检测器匹配 ： 　紫外吸收检测器不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶剂。 　示差折光检测器，不能使用梯度洗脱。 溶剂对样品有足够的溶解能力。 低粘度（易流动）和适当低的熔点。 溶剂的毒性小 * 仪器操作 1)．?过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．?对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．?打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相 管道，连接检测系统。 4)．?进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。? 5)．?有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10?ml/min。? 6)．?调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。? * 7)．?设计走样方法。点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。? 8)．?进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。? 9)．?关机时，先关计算机，再关液相色谱。? 10)．?填写登记本，由负责人签字 * 定量与定性 一、定性方法 1、利用已知标准样品定性 2、利用检测的选择性定性 3、利用紫外检测器全波长扫描功能定性 二、定量方法 1、归一化法：要求所有组分都能分离并有响应 2、外标法:标准曲线法、直接比较法 3、内标法：在被测组分中加入一种被测组分中不含有的参比物。 * 阿司匹林含量测定 一、试验仪器及试剂 仪器：高效液相色谱仪、色谱柱、紫外可见分光光度计、超声波清洗器、电子天平 试剂：甲醇、冰乙酸、阿司匹林对照品、样品 二、溶液的配制 1、阿司匹林对照品溶液 称取阿司匹林对照品0.005g，置于50mL容量瓶，加冰乙酸-甲醇（1：10）溶液使之溶解并稀释至刻度，摇匀。 2、样品溶液的配制 称取样品适量，置于100mL容量瓶，加冰乙酸-甲醇（1：10）溶液使之溶解并稀释至刻度，摇匀。 三、检测波长的测定 取阿司匹