第二章菌种的来源解读.ppt

X XXX X XX X XX X XXX X XX X X XXX XX X X XX X XXX X X XXX XX X X XX X XXX X XX X XX X XX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select best with DNAseI fragments recombinants Repeat for multiple cycles DNA shuffling 菌株选育、分子改造 2012-2-26 * 菌株选育、分子改造 项目 进化速度 进化对象 进化 周期 影响对象 突变效率 常规定向进化 缓慢进化 整个基因组 多年 完整基因组 低 DNA Shuffling 快速进化 特定基因/ 操纵子/病毒 几天 部分基因组 高 DNA Shuffling与常规定向进化的比较 2012-2-26 * 类 型 示 例 特 性 活性增加倍数 潜在应用领域 抗 体 人源抗体 亲和性 400 生物制药 酶 天冬氨酸转氨酶 催化特异性 10，000 生物制药 β -内酰胺酶 抗生素抗性 32，000 抗生素 枯草杆菌蛋白酶E 耐热性 65℃耐热时间 17 200 工业酶 细胞因子 人类干扰素 抗病毒 285，000 基因治疗 肿瘤抑制因子P53 37℃半衰期 12 基因治疗 代谢途径 砷酸盐代谢途径 砷酸盐解毒 40 生物制药 汞代谢途径 汞解毒 12 生物制药 部分DNA Shuffling技术的研究成果 菌株选育、分子改造 2012-2-26 * 第五节 菌种保藏 菌株选育、分子改造 在生产发酵中，高产具有重要经济价值的某一代谢产物的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一个成功的工业发酵过程极为重要。 2012-2-26 * 一、理想的菌种保藏方法应具备的条件 (1)经长期保藏后菌种存活健在； (2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。 2012-2-26 * 二、工业微生物菌种保藏技术 1. 冷冻干燥或真空干燥保藏； 2. 超低温或在液氮中冷冻保藏； 3. 转接培养或斜面传代保藏； 4. 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。 2012-2-26 * 2.1 冷冻保藏 冷冻保藏是保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速度。 冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。 2012-2-26 * 普通冷冻保藏技术(-20℃) 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内，然后贮藏于冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，后置于冰箱中保存。 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。 经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。 保藏过程中应注意控制保藏温度、培养瓶或试管应严格密封。 简便易行，但多数微生物不适宜用此法长期保藏。 2012-2-26 * 超低温冷冻保藏技术(-60 ～ -80℃) 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。 超低温冰箱的冷冻速度