2011-现代组织化学技术资料分析.ppt

Feulgen反应显示DNA 用稀盐酸处理切片，使DNA水解，打开脱氧核酸与嘌呤碱基之间的连接键（糖苷键），形成醛基，再与Schiff试剂作用，形成紫红色反应产物。 免疫组织化学（Immunohistochemistry）第一章 概述第一节 免疫组织化学的基本概念 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜 采用点扫描技术,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。清晰度和精密度大大提高。 图像数字化,在电脑中进行处理,提高图像的清晰度和分析的便利度。利用光电倍增管将很微弱的信号放大,使灵敏度大大提高 光学成像的分辨率提高30%-40% 用于观察细胞形态、细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量等。 说 明 1、组织薄片用酒精脱水时须在4℃下进行。 2、采用镍网或金网是因其不与OsO4 起反应。 切 片 载玻片的清洁： 切片粘合剂的使用：（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度涂片。（2）APES 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂(1ml+50ml丙酮)1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片(37℃过夜)→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O 1000ml 细胞爬片制作 将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。 待细胞生长达到60％以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。 细胞涂片制作 离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。 吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。 待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。 在细胞上加一层甘油放-20℃保存。 抗原修复 高压加热修复法① 切片脱蜡至水;② 0.3% H2O2甲醇处理切片10min;③ 蒸馏水洗;④ 切片放入0.01M 柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，连同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4min;⑤ 待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。 电炉加热修复法① 切片脱蜡至水;② 0.3% H2O2甲醇处理切片10min;③ 蒸馏水洗;④ 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10min左右;⑤ 待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。 微波修复法① 切片脱蜡至水;② 0.3%H2O2甲醇处理10min;③ 蒸馏水洗;④ 0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），于微波炉内微波辐射10min;⑤ 待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色 胃蛋白酶消化法① 切片脱蜡至水;② 0.3% H2O2甲醇处理切片10min;③ 蒸馏水洗;④ PBS洗3次;⑤ 滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20min左右;⑥ PBS冲洗3次;⑦ 按选择好的免疫组化该法进行染色。 胰蛋白酶消化法① 切片脱蜡至水;② 0.3% H2O2甲醇处理切片10min;③ 蒸馏水洗;④ PBS洗3次;⑤ 滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20min左右;⑥ PBS洗3次;⑦ 按选好的免疫组化染色方法进行染色。 注意事项 一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在 4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。 即用型抗体：理论上在4℃冰箱内 可保存半年左右。 PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。 三、出现假阴性的原因 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。 固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。 抗体浓度过低。 孵育时间太短，或孵育温度太低。 缓冲液pH值不正确。 四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。 五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。 免疫组织化学方法成功与否关键在于抗原决定簇的保存和暴露。组织经甲醛固定，甲醛的醛基与抗原蛋白的氨基交联，使抗原决定簇被掩盖，从而影响对蛋白表达的检测。要充分暴露抗原决定簇，通常用到抗原修复。 加热抗原修复法 酶消化法 Steaming temperature between 95 oC - 98 oC which