胰岛素的折叠解析.doc

胰岛素的折叠 张蓉 摘要 本文主要研究了人胰岛素原的体外折叠途径，在 HPI 的折叠过程中分离到四个主要的中间体 P1，P2，P3 和 P4。对四个中间体的结分析发现它们都是三个二硫键保持完整的二硫键异构体，其中 P1 含有两个非天然的链间二硫键，P2 含有一个天然的 A20-B19 二硫键，P3 含有 B7-A20 二硫键，P4含有 B7-B19 二硫键。其次，本文也阐述了C肽以及二硫键异构体在HPI折叠中的作用。 关键词：人胰岛素原（HPI） 二硫键异构体 折叠起始点 C肽 通过晶体衍射【1】和 NMR【2】对胰岛素的三维结构进行深入研究发现，它的三级结构示意图如图 1a 所示。A 链含有两个通过转角 A9Ser-A12Ser 相连的反平行的α螺旋（A2Ile-A8Thr 和 A13Leu-A19Tyr，分别称为 helix 2 和 helix 3），B链的中部含有一个α螺旋（B9Ser-B19Cys，称为 helix 1）。当胰岛素形成二聚体时，两个分子的 B 链羧基端 B23-B28 形成一个反平行的β片。B 链的羧基端与 A链的氨基端在空间结构上紧密相邻。胰岛素分子中的三个二硫键对于稳定天然的构象非常重要。A6-A11 包埋在分子的内部，靠近疏水核心，它被 Ala 或 Ser取代后会导致 helix 2 的破坏【3】；A7-B7 完全暴露在分子的表面，它的缺失能够破坏 A 链上的 helix 2 和部分 helix 3，从而导致整体构象比较松散；A20-B19 则一部分靠近疏水核心，另一部分暴露在分子的表面，它是三个二硫键中最重要的一个，缺失了 A20-B19 的 PIP 突变体不能正确折叠致使在酵母表达体系中不能被分泌4表达【4】。 对于一个含有二硫键的单结构域蛋白来说，稳定蛋白质的构象或驱使蛋白质折叠的作用力有两种，一是非共价相互作用，包括范德华力，疏水相互作用，盐健等，二是二硫键的共价交联【5】。两种作用力相互协调，共同来启动、指导蛋白质的折叠和维持它的高级结构。HPI 氧化折叠的过程就是这两种作用力交互支配蛋白质折叠的一个过程。 HPI 在体外折叠时一个较为详细的折叠途径的分子机制。 在氧化折叠的初期，还原的 HPI在氧化试剂的作用下，自由巯基随机碰撞形成分子内的三个完整二硫键，从而形成不均一的二硫键异构体（scrambled disulfide isomers）中间体, 在这些异构体中大部分是非天然的二硫键（P1，P2，P3，P4 中均含有至少两个非天然二硫键）。在这个过程中，二硫键的形成顺序没有一定的规律，因为这时二级结构和高级结构还没有最后形成，frdHPI 中的非共价相互作用不占主导地位，不能指导二硫键的配对。2）随后，这些二硫键异构体中的非共价相互作用开始逐步发挥作用并支配二硫键的重排，促使非天然的二硫键向天然二硫键的转变。在这个过程中，主要有以下步骤：a)在 P4 的再折叠过程中，B 链中 helix 1 的形成促使 B7-B19 的断裂并导致两个链间二硫键的形成。两个链间二硫键的一个重要作用是把 B 链的折叠信息很快地传递到 A 链，促使 A 链内部 helix 2 和 helix 3的形成。b）P4 中 B 链内部二硫键的断裂后如果形成了 A20-B19（如形成了 P2），在 A20-B19 的牵引下，B7 与 A 链上相距较近的三个 Cys(A6, A7，A11)的距离靠近，可以更为容易地形成二硫键；其中天然二硫键 B7-A7 形成后 A6-A11 自然形成并稳定了 helix 2 和 helix 3，从而形成天然的正确构象和二硫键配对；如果 B7 偶然与 A6 或 A11 形成了错误的配对，在 B 链中正确的折叠信息指导 A链的 helix 2 和 helix 3 形成过程中，会促使 B7-A6 或 B7-A11 断裂并重排为正确的 A6-A11 和 A7-B7，进而稳定 A 链的构象。C) P4 中 B 链内部二硫键断裂后如果 A，B 链间形成的均为非天然的二硫键（如形成了 P3 或 P1），首先 helix 1 由于 B7-B19 的断裂而顺利形成，然后错配的链间二硫键如 B7-A20 等仍然能够把B 链模板中的正确的折叠信息传递到 A 链，促使 A 链螺旋的形成，从而导致B7-A19 处于一种能量非常高的不稳定状态。因此，在自由巯基试剂的作用下，B7-A19 可以非常容易地重排为 A20-B19，进而进行同步骤（b）中二硫键和构象的协同调整。由以上推测所归纳出的 HPI 的氧化折叠途径如图 19 所示。从图中可以看出，在氧化试剂的存在下，frdHPI 依次快速而随机地通过形成一个和两个二硫键的中间体最终形成三个二硫键