第二章高效液相色谱法摘要.ppt

第二章 高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography HPLC） 目的要求： 1. 熟悉HPLC法的基本原理和测试技术。 2. 掌握HPLC法色谱条件选择、定性定量分析方法。 3. 了解HPLC法在中药研究中的应用。 第一节 绪 论 高效液相色谱法： 二十世纪六十年代末期，在经典液相色谱的基础上引入了气相色谱的理论和技术，采用高压泵、高效固定相，以及高灵敏度检测器发展而成的分离分析方法。 HPLC和经典LC的主要区别为固定相、输液设备和检测手段的差别；和GC的主要差别为分析对象和流动相的差别，和GC相同之处在于都具有分离和分析的功能，可以在线检测。 一、HPLC与经典LC区别 1．经典LC：只能做为一种分离手段。 常压或低压下输送流动相 固定相颗粒粗，粒径100μm，且不均匀，柱 内径1～3cm，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶 质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱效低 （H↑，n↓），色谱柱不能连续使用 分析周期长 无法在线检测 样品用量大，灵敏度低 2．HPLC：既可分离又可分析手段 高压输送流动相 固定相粒度小且均匀，粒径10μm（全多孔球形微粒，匀 浆装柱），柱内径2～6mm，溶质在固定相的传质、扩散速 度大大加快，柱效高（H↓，n↑），色谱柱可反复使用 分析周期短 可以在线检测 灵敏度高，如UVD的最小测定量可达10－9 g ，FD的灵敏度 可达10－11 g 二、HPLC与GC差别 1．分析对象 GC：主要用于挥发性、热稳定性好、且沸点较低的 物质的分析，高沸点、挥发性差、热稳定性差 、离子型、高分子化合物及生物活性物质不可 检测。只能分析占有机物总数20%的物质。 HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性 和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热 稳定性差及高分子和离子型样品均可检测。 用途广泛，能分析占有机物总数80%的物质。 2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合 作用力，只与固定相作用。且载气种类少，性 质接近，改变载气对柱效和分离效率影响小。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因 素，对分离起很大作用。流动相种类较多，可 供选择范围广，流动相极性和pH值的选择，是 控制柱效和分离效率的重要因素之一，选用不 同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以 增大分离选择性。 3. 固定相差别 GC： 多是固体吸附剂或在担体表面上涂渍液 体的固定相，且粒度粗。 HPLC：大都是新型的固体吸附剂、化学键合相 等，粒度小（一般1.7～10μm）。 4．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 三、HPLC的特点和应用 “三高” “一快” “一广” 高柱效（n=104片/米，远高于LC），高灵敏度，高 选择性，分析速度快，应用范围广泛，可以分析80%以上 的有机化合物，如生命科学、生物工程，环境科学、中 医中药及现代医学等领域的基础研究和应用工作中，都 离不开各种类型的HPLC色谱仪。 另外，流出组分容易收集，操作可以自动化，使用安 全，亦可用于样品的纯化制备（制备型HPLC仪） 。 四、HPLC法的局限性 流动相用的多种溶剂，较GC法成本高 易引起环境污染 梯度洗脱比GC法的程序升温操作复杂 不能分析高压下易分解、变性的具有活性的生化样品 第二节 高效液相色谱仪 近年来，高效液相色谱技术得到迅速的发展，如美国的Waters、P-E、SP、Agilent（HP）、Thermo、贝克曼，日本的岛津、日立，法国的吉尔森等公司都大量地推出自己的产品，更新换代非常迅速，基本原理和色谱流程都是相同的，仍然由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统、馏分收集及数据记录与处理系统组成。 （三）输液泵 作用：把样品带入到色谱柱中，使样品在固定相和 和流动相之间作用来实现分离。 恒压泵－－流量精度不稳 恒流泵－－常用，柱塞往复泵 柱塞往复泵：输液的脉冲性较大 。 双泵补偿法 ：由两个柱塞往复泵串联或并联 ，两 个泵的柱塞运动方向相反，克服了输液的脉冲性 ，使流速稳定。 输液泵必