一种新的对牛金黄色葡萄球菌分离株进行基因分型的方法——识别主要的SNP位点法解析.docVIP

 Identification of predominant SNPs as a novel method for genotyping bovine Staphylococcus aureus isolates 一种新的对牛金黄色葡萄球菌分离株进行基因分型的方法——识别主要的SNP位点法 兽医和生物医学科学系；兽医学院；明尼苏达大学;圣保罗，明尼苏达州,美国 关键词: 牛金黄色葡萄球菌, SNP分型，α-毒素，PCR诊断和测序 递交: 09/20/11 校订: 11/08/11 接收: 11/08/11 /10.4161/viru.3.1.18724 金黄色葡萄球菌是主要的一种对人类和动物有致病性的病原体。感染常导致人们因治疗和住院而花费越来越多的金钱,并且由于动物受感染后的治疗费用而给可使用的农畜产品带来经济损失的风险。在这里，我们描述了一个方案，该方案是关于人类白细胞抗原（编码一个毒素）区域内的主要的单核苷酸多态性的扩增和测序，人类白细胞抗原赋予一个与慢性和严重的牛乳腺炎感染有关的金黄色葡萄球菌分离株过度产生毒素的表型。我们通过第二轮的分析验证了我们的研究结果，证实了单核苷酸多态性是过度产生毒素菌株的一个有效的标记基因。对高毒性菌株的鉴定将使感染后的积极治疗成为可能从而限制疾病并且减少经济损失。如果样品已经分离好的话，本方案可以用易得的试剂和设备在短短72小时内完成对菌株的鉴定。 前言 金黄色葡萄球菌是一种重要的病原体，能引起轻微的皮肤和软组织感染、危及生命的坏死性肺炎、心内膜炎和人类中毒性休克综合征。它也是牛乳房炎主要的致病菌的代表1。金黄色葡萄球菌菌株持续上升的多重耐药性进一步使这些疾病的治疗变得复杂化，同时增加了在医学和兽医学领域相关治疗所造成的经济负担2,3。此外，金黄色葡萄球菌乳腺炎感染通常是亚临床型的，这进一步扩大了产奶量以及处理费用的损失4。 对金黄色葡萄球菌菌株的识别和分类是一种常见的实验室手段，并且对确定无性系分离能力、分离菌的患病率以及后来的爆发有重要的流行病学意义5。许多分子技术用于对金黄色葡萄球菌进行分类：多位点序列分型（MLST），抗生素敏感性测试，脉冲场凝胶电泳（PFGE）和以PCR为基础的分析。以PCR为基础的分析包括SCCmec分型，spa分型，coa分型，agr分型，噬菌体分型，自动重复PCR扩增，潘式白细胞毒素（pvl）PCR6-9。 除直接对菌株毒力基因进行PCR检测外，这些方法提供了基于先前收集的经验数据的一般特征分离物。本方案提供了一种直接的方法来识别具有一个过度产生α-毒素表型的并且可能引起严重的牛乳腺炎的菌株，从而允许治疗的尽快发起并减弱感染的蔓延。 牛金黄色葡萄球菌ET3克隆是国际上临床和亚临床分离出的常见的牛乳房炎分离株1,10。该ET3的ST151分型比其他ET3子类型更致命，并已显示出具有导致组织增生损伤和患有乳腺炎的模型小鼠死亡、升高RNAIII的水平和升高溶细胞毒素水平、以及升高一种毒素水平的作用10,11。α毒素是乳房炎的一种重要的毒力因子4,12,13。我们实验室和一些其它人已经表明，金黄色葡萄球菌ET3-ST151，包括RF122能产生一种毒素，ET3-ST151和RF122产生这种毒素的量要远远超过其它种从牛和人中分离出的金黄色葡萄球菌菌株产生该毒素的量11,14。该ET3血统主要是从牛分离出来的，但一直与人类感染有关1。此外，ST151分型受到的来自于肠球菌由于SauI限制修饰途径引起的基因突变所造成的万古霉素抗性基因转移的的水平要比正常情况下高500倍15。如果ET3/ST151能够成为一种能够成功感染人的细菌，尤其是在医院的环境中经常发现耐万古霉素entercocci和MRSA，这就带来了一个严重的潜在性的公共健康问题16。 最近，我们的研究小组发表了一份关于过度产生某种毒素的分子机制方面的调查。通过采用比较基因组，我们发现HLA启动子区域内主要的单核苷酸多态性（SNPs），它们与超生产α-毒素的毒性ET3/ST151牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的分离菌RF122相关14,15。此外，我们发现从各地明尼苏达州许多不同地区分离的菌株也会产生大量的毒素。我们对来自于牛的菌株进行测试后发现，58.3％（7/12）的菌株产生的毒素水平与RF122以及超产生毒素的菌株相似，85.7％（6/7）有相同的DNA序列和相同的HLA启动子区域内的应变RF122的单核苷酸多态性。这些SNP位点的发现提供了一个基于PCR序列的简单的方案，可直接鉴定具有超生产α-毒素表型的金黄色葡萄球菌分离株。 为了进一步证实该SNP位点作为过度产生毒素的金黄色葡萄球菌菌株的分子分型方案，我们获得了来自明尼苏达州大学的兽医诊断实验室（表1）的额外的样本，并分析了它们在羊的血毒素琼脂平皿（BAP