WB问题与对策资料讲解.ppt

谢谢！ 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * Pierce Western Blotting底物一览 SuperSignal ? Western 化学发光底物 Western Pico底物和Kit Pierce ECL Western Dura增强底物和Kit Western Femto 超高灵敏型底物Kit Lumi Phos碱性磷酸酶化学发光底物 SuperSignal ? 化学发光底物发光原理和特点 高灵敏度：比显色法高103-106倍 多种灵敏度选择：10-12-10-15 节约抗体:其它底物用量1/10－1/1000 强信号，长发光，8－24小时 底物稳定，常温保存 检测快速：1-5分钟 高特异性，高信/噪比 检测方便： X光片或CCD检测 多次曝光：选择满意的信号强度 反复检测：用不同抗体，对同一蛋白的不同决定簇进行反复检测分析 SuperSignal? Pico化学发光底物—性价比最高的底物 10-12检测灵敏度 ： 要求较高抗体稀释倍数 底物稳定性高 ： 底物常温下稳定保存至少1年 工作液常温下至少保持24小时 发光持续时间长 ： 8小时发光时间，可反复曝光 更节约宝贵的抗体: 一抗稀释倍数是1000－5000倍 二抗稀释倍数是20000－100000倍 与同类产品比，价格低 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行点杂交预实验，以确定具体的实验参数 SuperSignal?与ECL花费比较 如何选择合适的Pico底物或Kit 底物（50ml，100ml，500ml，1L） 标准检测Kit：500ml底物＋2ml山羊抗鼠，兔二抗 完整检测Kit： 500ml底物＋2ml山羊抗鼠＋兔二抗＋1L封闭液＋4包洗脱液 2. Pierce ECL Western Blotting Substrate 同样的灵敏度， 一半的价钱 无须优化任何条件 Pro#:32106(500mL); 32209 (250mL)；32109 (50mL) 3. SuperSignal? Dura-化学发光底物－发光时间最长的底物 24小时发光时间：比任何其它改良的HRP化学发光底物要长10倍； 10-14克级灵敏度 节省抗体：抗体稀释度达一抗1000-50,000和二抗50,000 -250,000倍，同样抗体可做25-50个WB 立即产生强烈信号，特别适合CCD仪器检测 工作液稳定24小时；常温保存一年 如何选择合适的Duro底物Kit 底物Kit：20ml 标准检测Kit： 100ml底物＋1ml山羊抗鼠＋ 1ml山羊抗兔二抗 200ml底物＋1ml山羊抗鼠＋ 1ml山羊抗兔二抗 产品：37071；34075；34076 4. SuperSignal? Femto化学发光底物－最灵敏的化学发光底物 最灵敏的化学发光底物： 10-15克 一抗稀释度：1/5000-100,000 二抗1/100,000-500,000 用于极端微量样品的检测 抗体珍稀样品的检测 稳定：4°一年，室温半年 免费Pierce高质量二抗 如何选择合适的Femto底物Kit 底物Kit：20ml 标准检测Kit： 100ml底物＋1ml山羊抗鼠＋ 1ml山羊抗兔二抗 200ml底物＋1ml山羊抗鼠＋ 1ml山羊抗兔二抗、 产品：34094；34095；34096； 5. 碱性磷酸酶化学发光底物：Pro#:34150 6. PIERCE HRP化学显色底物 7. AP化学显色底物 底物与膜孵育 X- 光片 曝光时间的掌握 显影和定影液 信号增强剂 第七步：曝光 特别推荐：不需反复作WB的选择一 选择抗体剥离buffer 无须反复电泳和转膜，节省宝贵时间 节省珍贵的样品 温和的无气味配方，对娇嫩的蛋白质丝毫无损 一份样品，一次电泳，一次转膜，多次印迹，更多数据 不需反复作WB的选择二：X光片背景去除试剂 用于各种X光片的背景处理，例如常规的Western、Northern、Southern、EMSA等。 特点/优点： 去除不需要的背景，包括过度曝光、抗体浓度过高，封闭差，抗体/酶沉淀形成的高背景、阴影、杂点等 不需要费时的重