植物细胞培养与次级代谢产物制备资料.ppt

Chapter 5 细胞工程 ?琼脂糖(Agarose)固定化： （1）凝块法：将细胞悬浮于灭菌的琼脂糖中，搅拌待凝结包埋细胞后，将凝块挤进无菌金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。 （2）模铸法：同卡拉胶法 （3）两相法：同卡拉胶法 ?优点：与海藻酸盐、卡拉胶等固定化方法相比，不需要其它离 子来保证胶的稳定性。 ?不足：制得的颗粒较大、形状不规则。 3、琼脂糖(Agarose)固定化 Chapter 5 细胞工程 ?固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有： （1）荧光染色观察法：根据活细胞对FDA（二乙酸荧光素）黄绿色荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定。 （2）呼吸强度测定： 用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。 （3）细胞分解和生长速率的测定： 通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。 2.5.2 固定化细胞活力测定 Chapter 5 细胞工程 常用的反应系统有2种： ?流化床生物反应器(Fluid-bed bioreactor)：通过通入液体或气体使固定化细胞悬浮于反应器中； 优点：细胞包埋颗粒小，传质效率高；缺点：剪切力或碰撞会破坏固定化细胞。 2.5.3 植物细胞固定化生物反应器 ? 细胞固定在支持物（如筛网）的内部或表面，细胞固定不动，培养物流体按一定方向（从下向上）从反应器中流过实现混合和传质。 优点：单位体积细胞的容量大。 缺点：①混合效率低、细胞颗粒大，易造成传质困难；②固定床颗粒或支持物碎片会阻塞液体的流动；③固定材料易变形，阻塞筛网。 细胞固定化生物反应器 ? 填充床生物反应器(Pipe-cone bio-filter reactor) ? 两相培养技术：指在细胞培养体系中加入有机溶剂（如豆油、石蜡油）或吸附性的多聚化合物，而细胞在水相生长，合成的次级代谢产物立即转移到有机相，减少了对产物的反馈抑制作用，提高了产量，再通过对有机相的不断回收与循环利用，实现连续培养。 要求： ①有机相对细胞无毒，不影响细胞生产与产物合成； ②产物易溶于有机相中； ③水相与有机相易分离； ④有机相或多聚化合物不能吸附培养基营养成份。 2.6 植物细胞两相培养 植物天然产物包括初级和次级代谢产物： ? 初级代谢产物（Primary metabolites） 是通过初级代谢 产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。在不同种类的细胞中，初级代谢产物的种类基本相同。任何一种初级产物的合成发生障碍都会影响细胞正常的生命活动，甚至导致死亡。 ? 次级代谢产物（Secondary metabolites） 是通过次级代 谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点。 §5.3 植物细胞培养生产次级代谢产物 优点： ?减少耕地占用，不受季节、地域限制； ?可以排除病菌和害虫的影响(密闭无菌操作)； 可通过选择优良株系和优化培养条件提高代谢物产量； 能通过改造生物合成途径获得新有用物质。 由于资源短缺和需求量增加，依靠从栽培植物提取天然的次级代谢产物途径很难满足人类需求，而利用植物细胞生物反应器大量培养次生代谢产物成为最有效途径。 Chapter 5 细胞工程 1、药用代谢产物 这是重要应用领域，包括生物碱、萜类、苷类、酮类等。 ? 例如，紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植物中分离得到的一种二萜烯类化合物，治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的药物。 通过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物 需求：仅美国每年就有50 000名妇女患卵巢癌，每年需约24kg紫杉醇；还有约40 000名妇女死于乳腺癌，年需求量将增至100kg。全世界每年需要500kg紫杉醇才能满足广大癌症患者需求。 生产1 kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。紫杉醇在树皮、嫩芽中含量最高。若光从树皮中提取紫杉，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。 2、天然食品和食品添加剂 如胡萝卜素、叶黄素、甜菊苷、辣椒素等，因为化学合成色素和甜味剂越来越受到担心和严格限制。 3、杀虫剂和杀菌剂 如利用万寿菊细胞生产噻吩烷，香草生产鱼藤酮杀虫剂。 4、饲料、精细化工等产品 如用培养的槡、榆等细胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供应蚕养殖业的饲料。 精细化工产品种类繁多（36类），附加值高，具有功能性或最终使用性。除上述医药、农药、添加剂外，还包括染料、涂料、香精、洗涤剂、化妆品、金属表面处理剂、芳香消臭剂等产品。 通过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物 ?聚酮途径：聚酮类化合物包括抗生素、免疫