第九章凝胶过滤及要点解析.ppt

第九章 凝胶过滤及离子交换层析介质 广东省韶关学院生物科学系 第一节 概 述 自茨维特 1903年发明色谱法以来，该方法已经广泛用于生物分子的分析分离与制备。在蛋白质、多糖、天然产物的分离纯化与除热源等方面得到了广泛的应用。 其中的填料——色谱介质，是决定色谱分离效果的主要、最重要的因素。 目前，各个国家的许多公司，均有专门的色谱出售。有的用于分析效果好，有的适合大规模制备使用。 60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的研制成功，使色谱实现机械化、自动化操作，提高了操作的复现性。这类全自动的生产规模级的层析系 统（如 瑞典Pharmacia com.的BioprocessⅠ、），能高速处理大量样品，流速从4-20L/h到40-400L/h，能满足各类规模生产的需要。他们的填料特点是： 1、适用于实验室和大规模生产，重现性高。 2、易清洗、消毒和再生，理化性质稳定，使用寿命长。 3、易装柱，高工作容量，高流速，利于工业化生产。 1975年Small提出了离子交换色谱法，1981年Jorgenson创立了毛细管电泳法。 20世纪90年代后，出现的扩张床吸附技术，通过一步纯化，达到萃取、浓缩和初步纯化的目的，所用的填料是STREAMLINE介质——一种以Sepharose为基架的介质。 2004年GE Healthcare (原安玛西亚公司) 推出的新一代EBA扩张柱STREAMLINE Direct柱，消除了样品和气泡容易堵在筛网下的问题。 各种用于大规模大分子分离纯化生产的色谱方法见表9-1，需注意他们的分离原理、特点和应用。 第二节 凝胶过滤介质 一、凝胶过滤 概念：又称排阻层析或分子筛方法，是利用凝胶网状结构，根据分子的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化的方法。 凝胶过滤的优点： ①介质稳定，不带电，不与溶质反应， 蛋白质不易变性。②适应面广，对各种大小的分子均适用。③设备简单，易操作，耗时少，可连续操作。 常用于脱盐和分级分离。分级分离是将分子大小相近的物质分开，且要选择合适的凝胶，单次上样量小，一般为床柱体积的5%-10%。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开 二、凝胶介质应具备的条件 优良的凝胶介质是获得良好分离效果的前提，介质必须： 1、惰性材质，不与溶质和溶剂反应。 2、没有或极少的非特异性吸附，提高回收率。消除带电基团。 3、介质内孔径大小分布均匀，孔径分布要窄，才能保证分离效果好。 4、凝胶珠大小均匀，均一性好。细粒填料能提高柱效。 5、机械强度高，易于消毒，能反顾使用。 三、凝胶介质的种类 主要为人工合成大分子和天然多糖类 1、多糖类骨架 这类多糖有纤维素、葡聚糖和琼脂糖 这类介质生物相容性好，亲水性强，不会导致生物分子变性失活。由琼脂糖和葡聚聚合而成的糖新一代复合凝胶——Superdex高效过滤介质，使生产效率进一步提高，从小规模过滤延伸到大规模生产。 2、合成大分子骨架介质 这类介质有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇系和含羟甲基酰胺类等。克服了天然介质易受微生物侵蚀的缺点，保留了多糖骨架亲水的优点。 3、天然大分子与合成高聚物构成混合骨架的介质 既亲水抗微生物侵蚀，又有很好的生物相容性和刚性。 凝胶层析分类 Sepharose FF系列?? Sepharose 6 FF??10000~4000000??45~165微米??质粒、病毒??Sepharose 4 FF??60000?45~165微米??病毒，rHBsAg等巨大分子Sepharose xB（CL-xB）系列?? Sepharose 2B??70000?60-200微米??大分子复合物??Sepharose 4B??60000?45-165微米??病毒等大分子??Sepharose 6B??10000~4000000??45-165微米??大分子 ?Sephadex G-75 superfine??3000-70000??10-40?? Sephadex G-100??4000-150000??40-120??较大蛋白 的分离 Sephadex G-100 superfine??4000-100000??10-40 Sephadex G-150??5000-300000??40-120??大蛋白的 分离 Sephadex G-150 superfine