Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核表达载体的构建及表达鉴定.pdfVIP

生物技术通报 ·研究报告 · B IO TECHN OLO G Y　BULL E T IN 2009年第 7 期 I型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核 表达载体的构建及其表达鉴定 1 1 2 2 1 1 3 樊萍 　杨竹 　胡接力 　崔静 　汤雄文 　王露颖 　甘胜伟 ( 1 重庆医科大学附属第二医院妇产科 ,重庆 4000 10; 2 重庆医科大学感染性疾病重点 实验室 ,重庆 4000 16; 3重庆医科大学解剖教研室 ,重庆 4000 16) ( ) 　　摘 　要 : 　为构建单纯疱疹病毒 I型胸苷激酶 H SV1 TK 的真核表达载体 p cDNA3. 1EGFP /H SV1 TK,鉴定其在真核细胞中 的表达和功能。以 pORFH SV1 TK为模板 , PCR 扩增的目的基因 HSV1 TK 片段与 pMD 18T载体相连接构建重组克隆 pMD 18T/ H SV1 TK。再双酶切出 HSV1 TK片段 ,插入 p cDNA3. 1EGFP多克隆位点 ,构建 p cDNA3. 1EGFP / H SV1 TK真核表达载体并进行酶 切 、测序鉴定 [ 1 ] 。分别用荧光显微镜观察和 RTPCR 方法检测脂质体介导 p cDNA3. 1EGFP / H SV1 TK在卵巢癌细胞 SKOV3 的表 ( ) 达 ;分别用 M TT法和光镜检测胸苷激酶 /丙氧鸟苷 H SV1 TK/ GCV 系统对 SKOV3 体外杀伤作用及旁观者效应 。结果表明,重组 载体酶切鉴定结果与预期结果一致 ,基因序列与 GenB ank上报道的 HSV1 TK基因序列完全一致 。荧光显微镜观察转染后的细胞 发出绿色荧光 ; RTPCR 结果表明 HSV1 TK基因能在 SKOV3 内有效表达 。M TT和光镜结果显示转染 HSV1 TK 基因的 SKOV3 细 ( ) 胞 ,加入前体药物丙氧鸟苷 GCV 处理后对其有明显的杀伤作用和旁观者效应 。成功构建的真核表达载体 p cDNA3. 1EGFP / H SV1 TK能在 SKOV3 细胞中稳定表达 ,且 H SV1 TK对卵巢癌细胞株 SKOV3 体外有强大的杀伤作用和旁观者效应 。 关键词 : 　自杀基因　胸苷激酶 /丙氧鸟苷 　真核表达载体 　旁观者效应 　卵巢癌 Con struction of Enhanced Green Fluorescen t Prote in and HSV TK 1 Coexpression Vector and Expre