EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立.pdfVIP

生物技术通报 ·技术与方法· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年第 期 2014 6 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 检测猪圆环病毒 2 型 方法的建立 蔡晔  饶品彬  吴海港  姜永厚 （浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018） 摘 要 ： 根据GenBank 中的猪圆环病毒2 型 （PCV2 ）ORF4 基因序列设计一对特异性引物，通过常规PCR 扩增PCV2 的 ORF4 基因，并将其纯化的PCR 产物克隆入pMD18-T 载体中，构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen 实时荧光定量PCR ， 建立了PCV2 DNA 的标准曲线，并进行熔解曲线分析。结果显示 ：建立的EvaGreen 实时荧光定量PCR 特异性强，与其他非靶标 病毒基因不发生交叉反应；灵敏度高，最高可检测到10 拷贝/μL 的病毒量；重复性好，3 个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5% ； 对118 份临床样品进行检测，阳性样品25 份，阳性率为21.2% ，检测结果与普通PCR 相符率为99.2% ，其中一份样品经荧光PCR 检测为PCV2 阳性，普通PCR 检测为阴性。结果表明，建立的EvaGreen 实时荧光定量PCR 方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、 简便快捷等特点，可用于临床PCV2 感染的早期诊断以及分子流行病学调查。 关键词 ： 猪圆环病毒2 型 EvaGreen 实时荧光定量PCR 检测 - Development of EvaGreen Real time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction to Detect Porcine Circovirus Type 2 Cai Ye Rao Pinbin Wu Haigang Jiang Yonghou - （College of Lif e Science ，Zhej iang Sci Tech University ，Hangzhou 3100 18 ） Abstract:  According to genome sequences of ORF4 of porcine circovirus type 2 （PCV2 ）published in GenBank, a pair of primers was designed. The ORF4 gene was amplified with traditional PCR. The PCR product was cloned into pMD18-T vector and sequenced to construct positive recombinant plasmid. The recombinant plasmid was used as template for EvaGreen real-time PCR to generate standard curve and melt curve. The results showed that EvaGreen real-time PCR in the present study wa