红色原鸡外周血单个核细胞IFN-γ的诱导表达及荧光定量PCR检测.pdfVIP

生物技术通报 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年第 期 2014 4 红色原鸡外周血单个核细胞 IFN-γ 的诱导表达及其 荧光定量 PCR 检测 1 1 1 1 1 2 1 孙亭亭  冀斌  马志亮  胡文丽  鲁琼芬  张雄伟  陈培富 （1. 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201 ；2. 云南省红河州金平县畜牧局，金平 661500） 摘 要 ： 为建立检测红色原鸡外周血单个核细胞 （PBMC ）中干扰素γ （IFN-γ）mRNA 表达水平的方法，通过优化刀豆蛋白 A （Con A ）诱导PBMC 表达IFN-γ 的条件，采用RT-PCR 方法以3-磷酸甘油脱氢酶 （GAPDH ）基因为内参扩增IFN-γ基因，插入 克隆载体pMD18-T 分别构建重组质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH ，以其作为标准品采用SYBR Green I 染料法建立荧光定量PCR 检 测方法，并将该方法应用于34 只红色原鸡PBMC IFN-γ表达量的检测。结果发现，PBMC 在20 μg/mL Con A 刺激培养12 -25 h 时 IFN-γ 处于高表达水平 ；标准品质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH 分别在拷贝数6.72 ×102 9 2 9 -6.72 ×10 、3.94 ×10 -3.94 ×10 范围内与 其对应的Ct 值呈现良好的线性关系（ 2 0.99 ），扩增产物的熔解曲线均只有特异的单峰，表明所用引物特异性强。在优化Con A R 诱导红色原鸡PBMC 表达IFN-γ条件的基础上，建立了可用于定量检测红色原鸡PBMC IFN-γ mRNA 表达水平的荧光定量PCR 方法。 关键词 ： 红色原鸡 干扰素γ Con A 诱导 荧光定量PCR 外周血单个核细胞 - -γ Induced Expression and Real time PCR Detection of IFN from PBMC in Red Jungle Fowl 1 1 1 1 1 2 1 Sun Tingting Ji Bin Ma Zhiliang Hu Wenli Lu Qiongfen Zhang Xiongwei Chen Peifu （1.College of Animal Science and Technology ，Yunnan Agricultural University ，Yunnan Kunming 65020 1 ；2. B