优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变.pdf

生物技术通报 ·研究报告 · B IO TECHN OLO G Y　BULL E T IN 2009年第 7 期 优化重叠 PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变 符勇耀 　李正国　李泮志 　邓伟 　杨迎伍 　王中康 (重庆大学生物工程学院基因工程研究中心 重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室 重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心 ,重庆 400030) 　　摘 　要 : 　利用重叠 PCR 技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点 , 国内外文献未见 其方法学的系统报道 。以不同 VH 、VL 和 L inker基因为拼接模板进行重叠 PCR ,针对影响重叠 PCR 扩增的拼接类型 , 引物设 计 ,反应条件等进行优化 。结果表明两段重叠连接比三段更容易实现 ,且扩增效果好 ; 引物的互补序列长度一般应大于 15 bp , 2 + 且在 18～24 bp 时扩增效果最好 ;退火温度在 52 ～60 ℃,M g 浓度在 1. 5～2. 5 mM 时对拼接的效果影响较小 ;直接或间接使 用拼接模板均可以实现重叠 PCR 的扩增 。利用优化策略 ,首次构建了抗除虫菊酯的 scFv基因文库并引入抗 XAC糖蛋白 scFv 基因的点突变 ,为除虫菊酯抗体文库构建和抗 XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础 。 关键词 : 　重叠 PCR 　优化 　单链抗体基因　点突变 Study of Single Cha in Fv s Splic ing and Sited irected M utagenesis Ba sed on O ptima l Overlap PCR Fu Yongyao　L i Zhengguo　L i Panzh i　D eng W ei　Yang Yingwu　W ang Zhongkang ( Genetic E ng ineering R esea rch Cen ter of B ioeng ineering College, Key L abora tory of F unctiona l Gene and N ew R eg u la tion Technolog ies under Chong qing M un icip a l E duca tion Comm ission, E ng ineering and Technology R esea rch Cen ter f or F ung a l Insecticides of Chong qing, Chong qing Un iversity, Chong qing 400030) 　　Ab s tra c t: 　Single chain Fvs sp licing and sitedirected mu tagenesis by overlap PCR is a key po int in con struction of an tibody li b rary and stab le exp re ssion of an tibody. Several asp ects affecting overlap PCR amp lification, including sp licing typ es, p rim er de sign, re action condition s and u se p attern s, were exp lored. The resu lts indicated that sp licing by two fragm en tswas e