硒蛋白S基因表达和过氧化氢介导的ECV-%2c304-细胞损伤关系研析.pdf

硒蛋白S基因表达与过氧化氢介导的ECV304细胞 损伤关系的研究 硕士研究生： 刘 颖 指导教师： 杜建玲教授 指导小组： 邢倩副教授 专业名称： 内科学 摘 要 S，SelS)基因干 目的：体外构建含shRNA的硒蛋白S(Selenoprotein 扰质粒及SelS基因高表达质粒，将其瞬时转染至人脐静脉内皮细胞株 染组及SelS低表达组，以不同浓度的过氧化氢(H202)损伤后，观察各 路发挥作用，及此通路与Cav．1的关系，为研究内皮保护策略提供新的 实验依据。 方法： 应用脂质体转染技术将质粒瞬时转染至ECV304细胞中，以GAPDH为内 参照半定量检测SelS mRNA水平的表达，筛选有效干扰质粒。 2．将ECV304细胞分为未转染组、SelS高表达组、空载体转染组及 mRNA SelS低表达组，以GAPDH为内参照，实时定量PCR方法检测SeIS blot方法检测SelS蛋白水平 水平的表达；以IB-aetin为内参照，Western 的表达。 3．各组细胞分别经含有终浓度为0、400、600、800及1000Ltmol／L 胞增殖能力的影响；取不同浓度损伤的各组细胞上清液，硫代巴比妥酸 法测定丙二醛(MDA)的含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶 (SOD)的活力。 胞24h后，提取各组细胞总RNA及总蛋白，采用实时定量PCR方法检 测各组细胞Cav一1及PKCa mRNA水平的表达；Westernblot方法检测 Cav-1及PKCa蛋白水平的表达。 结果： 1．成功构建SelS基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒，而且设计 的三条干扰质粒均可干扰内皮细胞中SelS基因的表达。实时定量PCR及 Western blot证实SelS低表达组的SelSmRNA及蛋白表达水平均较未转 染组、SelS高表达组及空载体转染组明显减低，未转染组与空载体转染 组表达无差异(P0．05)。 液中6h后，细胞生存率明显下降；各浓度组的细胞生存率在SelS低表 (644-0．5，454-2．6，P0．0 空载体转染组与未转染组相比差异不显著(P0．05)。 (6．52+0．1 6)的MDA水平高于SelS高表达组(3．69士0．16，P0．05)；在 H202浓度为800、1 000I．tmol／L时，SelS低表达组(1 0．1 的MDA水平则高于未转染组(10+0．40，1 水平在这三个浓度(3．69+0．16，6．24士0．51，l0。414-0．35)均低于未转染 组及空载体转染组(P0．05)；H202浓度为l0009mol／L时差异更为显著 (P0．01)：空载体转染组与未转染组相比差异不显著(P0．05)。 度的升高而减弱；在H202浓度为600、800、l 24-1．63， l 活力(8．34+0．1 染组，在H202浓度800、l 空载体转染组与未转染组相比无差异(P0．05)。 5．Cav．1的表达：ECV304细胞暴露于含800}tmol／LH202的培养液 VS1．14士0．04， 中24h后，Cav．1mRNA表达在未转染组(1．56士0．07 2 vs