流感病毒NS1蛋白对细胞生长调控及和Nucleolin相互作用的研究.pdf

摘要 甲型流感病毒属于正黏病毒科，基因组由8股负链的RNA组成，其中第8 节段RNA编码非结构蛋白NSl，该蛋白在受感染的宿主细胞中合成，在调控病 毒致病性和毒力，影响宿主细胞免疫反应及凋亡等多个方面具有重要作用。 蛋白相比较，在C端缺失了RKMARTIKSE10个氨基酸，即PL结构域。其余位 点共发生了32个氨基酸变异。 为进一步研究甲型流感病毒NSl蛋白对真核细胞的作用，本研究通过 等5种NSl真核表达载体。利用脂质体法将重组载体转染A549细胞，应用 WesternBlot方法，检测NSl蛋白表达量，通过对转染试剂体积、质粒质量等优 化，获得高效转染A549细胞条件为：脂质体2000 96h 9此，质粒2岭，瞬转NSl 后，NSl蛋白的表达量达最高值。 察表达NSl蛋白的A549细胞形态，细胞出现皱缩，体积变小，变圆，细胞核固 缩，染色质边缘化等细胞凋亡现象。应用AnnexinV染色法检测细胞凋亡，实验 组阳性细胞数均高于空白和阴性对照组，且A549／1918NSl的阳性细胞数高于 A549／2009NSl；利用流式细胞仪检测细胞周期，发现实验组细胞周期发生G2／M 期阻滞，且A549／1918NSl G2／M期与Apoptotic期的细胞比例均大于 A549／2009NSl；利用WesternBlot方法检测NSl蛋白对细胞周期关键蛋白的影 的磷酸化，且1918NSl蛋白对这些蛋白的作用大于2009NSl蛋白。结合以上结 果推测NSl蛋白能够通过上调p53、p21蛋白表达、促进p53磷酸化，使细胞周 与2009NSl缺失PL结构域有关。 应用TAP亲和纯化技术获得TAPNSl蛋白与其相互作用蛋白的复合物，通 PullDown技术进一步验 过Westernblot检测NSl相互作用蛋白Nucleolin，GST 1．82aa。这 证了NSl蛋白与Nucleolin具有相互作用，且相互作用位点位于NSl 为进一步研究NSl蛋白调控真核细胞细胞周期及诱导其凋亡的机制奠定了基础。 关键词：流感病毒；NSI蛋白；真核表达；细胞周期；凋亡：相互作用；Nucleolin 蛋白 ABSTRACT InfluenzaAvirusesare viruseswithinthe enveloped familyOrthomyxoviridae， and containa RNA they single-stranded，negativesense，segmentedgenome of ofviral 1 isencodedona consistingeightsegments RNA(vRNA)．NSprotein collinearmRNAderivedfromvRNA isnotastructural segmenteight．It component ofthe is at levelsin virion，but very infectedcells．TheNS1 expressedhigh protein an roleinthe ofviral and also playsimportant regulationpathogenicityvirulence，and has on