人肿瘤坏死因子α30和42位氨基酸突变体结构和生物活性的分析.pdf

中眉，协和压科大学中茸压掌群掌崩：搏士掌芷耀哎 中文摘要 人肿瘤坏死因子(hTNFa)因其能在体内、外能特异杀伤肿瘤组织细胞而 被认为是一种很有潜力的抗癌药物，然而它的毒副作用大大地限制了它在临床 中的应用。为了降低hTNFa的毒副作用，保持和增加抗肿瘤活性，我们对hTNFa 编码区基因进行改造，从而进一步研究hTNFa突变体结构和功能的关系。 hTNFa对大多数肿瘤细胞的杀伤作用，是通过与肿瘤细胞膜上特异性受体 结合后，触发细胞内信号转导而使靶细胞产生凋亡效应。根据对hTNFa结构及 N端8个氨 功能关系研究的深入了解，利用PCR介导的定点突变删除hTNFa 基酸，同时在30、42位氨基酸进行突变，获得了4个突变体，ml是单独缺失 N端8个氨基酸：其它突变体是在ml的基础上叠加突变，即m2是Asn30Asp， 其中m4以包涵体蛋白形式存在，其余以可溶性蛋白存在。分别对各突变体蛋 白进行了纯化，之后从不同角度分析其特性。利用其能与相应抗体特异结合的 性质进行WesternBlot检测及免疫沉淀实验，定性、定量地检测hTNFa一级结 构改造后其三维构象的变化对hTNFa基本构型和对抗原决定簇空问构象的影 响。WesternBlot检测结果发现各个突变体均能与抗野型hTNFa多克隆抗体发 生特异性结合，说明各突变体仍以hTNFa的基本构型发挥其功能；等量的放射 性标记的各突变体蛋白与等量抗野型hTNFa单克隆抗体结合后，产生了有差异 的放射自显影条带，说明各突变体与单克隆抗体结合的抗原决定簇空问构象发 生了一定的变化。分析各突变体的构象变化与生物学功能活性之涮的关系，首 选指标就是体内、外抗肿瘤活性及毒性的测定。从此测定可知，m2、m3突变 体与野型hTNFa相比，比活性升高达103数量级，体内引起的肿瘤组织出血坏 死较重(P0．01)，毒性分别为野型的2倍和1．7倍，比活性与毒性之间的比例 相差很大，表明构建的m2、m3两个突变体抗肿瘤活性的增加，并未同比例的 使其毒性增强，即这两个突变体对肿瘤组织细胞杀伤作用的增强是相当特异的。 为深入分析我们所得到的几个突变体的结构和功能的关系，我们设计了利用差 异显示分析来探索不同结构变异体所引起的细胞基因反应的实验，以期从中了 解有关不同突变体诱导细胞发生不同效率的凋亡效应，探索不同突变体结构之 问的差异所导致的不同生物学功能活性的可能机理。从结果可知，hTNFct及各 突变体刺激细胞产生的基因反应有一定的差异，从这些差异表达的mRNA中已 分离到若干新的EST序列。这些有趣的基因反应差异为我们对hTNFct突变体 的结构分析提供了一定的资料，亦为我们进一步的工作提供新的视野。7+ 关键词：人肿瘤坏死因子突变体结构与功鲁} 细胞凋亡 基因反应 ≠目#≯E#^#≠目E##掌W目E±学m《!．Z Abstract Humantumornecrosisfactor a cytokine alpha(hTNFu)，as pleiotropiccapable cellinvitroandin been of tumor vivo，has a anti—tumor thought killing potential side its inclinic．In reduce its effects orderto systemic agent，but limitingusing