溶栓抗凝双功能融合蛋白构建表达及在血栓疾病治疗中应用的研究.pdfVIP

摘 要 靶向溶栓抗凝双功能融合蛋白及其在血栓疾病治疗中的应用 博士后 石炳兴 导师 吴祖泽 心脑血管血栓性疾病是人类的近年面临的头号杀手。溶栓和抗凝药物组合 应用是临床治疗血栓疾病主要给药方案，出血倾向是血栓治疗的主要副作用。为 提高葡激酶的选择性、降低葡激酶的临床用药量，同时，降低水蛭素在非血栓部 位的浓度或活性从而减小出血的危险，我们利用水蛭素对凝血酶的高亲和性和N 一末端延伸引起活性降低的特性，首次设计并构建了通过含有凝血因子FXa识别 的六肽连接的葡激酶与水蛭素的融合蛋白，使之具有靶向溶栓抗凝双功能和减小 出血倾向等特性。 融合蛋白在毕赤酵母中表达时，葡激酶因第28位天冬酰氨被糖基化而失去 并在甲醇利用型毕赤酵母中得到高效分泌表达，甲醇诱导96h，摇瓶发酵表达量 达到lg／L，发酵上清液目的蛋白含量占总蛋白的70％以上，第28位天冬酰氨不 发生糖基化；但表达产物不可逆地丧失葡激酶的活化纤溶酶原活性。研究还表明， 析表明，所突变的三个氨基酸使得葡激酶的B折叠结构受到破坏，影响了葡激酶 与纤溶酶原的结合，从而使之活性丧失，同时表明SAK的24至30位氨基酸残基 形成的0折叠结构对维持其活性和功能是必需的。 将融合蛋白基因克隆到pBV220载体并在大肠杆菌中得到了高效表达。融合 蛋白以可溶性蛋白的形式存在与大肠杆菌的细胞质中，采用反复冻融提取、离子 交换和凝胶过滤方法纯化了目的蛋白，纯度达96％以上。①融合蛋白对凝血酶具 有一定的靶向性②完整的融合蛋白具有显著的溶栓功能，丧失抗凝活性，从而 可减小出血倾向；但融合蛋白在Fxa作用下发生裂解，从而释放出游离水蛭素具 有抗凝功能，表明融合蛋白可在血栓部位具有靶向溶栓抗凝双功能。③采用卡拉 胶诱导的小鼠尾部血栓动物模型实验表明，融合蛋白组小鼠尾部血栓较葡激酶组 明显降低，同时尾部血栓形成频率也明显减少，表明融合蛋白具有更好的抗血栓 效果。融合蛋白具有良好的应用开发前景。 关键词：融合蛋白，溶栓，抗凝，血栓，水蛭素，葡激酶 Abstract and CharacterizationofRecombinantBifunctional Design Targeting FusionPmteinfor ofThmmbosis Therapy ofmmmboemb01ic Despitesuccess血11”ictherapy disorder，reocclusionofthe vessels reduces e行ect． d锄aged orbleeding complication丘equennyt11eⅡ1e瑚【peutic e肋rtstocombinethebenefitsof and for Making mromb01”icsanticoagulatlts ofVesselreocclusionandtoalleviatet11eirsidee腩ctof preVemion bleeding a bifImctiomlfusion asSFH complication，we protein，teⅡned designedtargeting hinldm FXa (s扭phylokimse、vitlllinkedbyrecogllitionpeptide)．