牛微小隐孢子虫CP15抗原高级结构预测分析及GST融合表达载体的构建.pdf

摘 要 隐孢子虫病（Ｃryptosporidiosis）是由隐孢子虫（Ｃryptosporidium）引起的 全球性人畜共患寄生虫病。微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是该病的主要病 原体，它是属于顶端复合物门的寄生性原虫，可引起人和多种动物的严重腹泻，是引 起免疫缺陷病人死亡的主要原因之一。所有被感染的生物体都会通过粪便向环境排泄 隐孢子虫卵囊，而这些卵囊主要通过污染水源，如饮用水、游泳池、河流、湖泊等再 感染其他人和动物，故对人类公共卫生造成很大威胁。随着分子生物学的发展，已经 发现隐孢子虫功能性抗原基因主要有7种，其中对编码子孢子表面抗原的基因的研究 最为深入，主要有 Cp15、Cp23、Cp15/60 等抗原。虽然很多研究者对本病的防治进 行了大量的研究，但至今尚无一种行之有效的防治方法，因此研究该病的诊断试剂和 疫苗迫在眉睫。 本研究利用PCR 方法，从已经构建的隐孢子虫子孢子cDNA 文库中克隆出子孢子 抗原Cp 15基因，将其克隆到pMD19 （T）载体中，命名为pMD19－Cp15。对筛选出的 阳性克隆进行基因序列测序和分析，应用生物学分析软件 ExpasyProtparam (/protparam)、Swiss-Model()、SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.ht mL) 和 Psipred （http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred ）等对Cp15 基因序列和氨基酸序列进行预测分析， 并用Swiss-PdbViewer 等三种软件对CP15 蛋白进行了高级结构预测，为获得有效的 基因片段提供了理论依据。结果发现：Cp15 基因可编码 126 个氨基酸残基的多肽， 预测蛋白质的分子量为14.79 KDa ，理论等电点为4.84，亲水氨基酸比例达到59.5%。 结构分析发现，蛋白质可能具有2 个螺旋区，无规则卷曲和线性结构构成二级结构的 主要成分，B 细胞表位可能处于50-58、76-89、110-115 等几个肽段。此外，将pMD19 －CP15 经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切处理后的Cp15 基因，定点克隆到pGEX4T-3 载体中， 构建了大肠杆菌中GST 融合表达的重组载体pGEX-Cp15，将其转入到E.coli BL21 中， 并用 IPTG 进行诱导表达融合蛋白质 GST-CP15。对融合 CP15 蛋白的表达情况进行 SDS电泳和Wester-blotting 鉴定。利用高效表达的CP15 抗原建立了重组-间 接ELISA 方法，用田间山羊和牛血清初步估计了隐孢子虫病在本地区的检出率。本试 验为进一步探索诊断和预防隐孢子虫病的候选抗原肽的研究奠定了基础。 关键词：牛微小隐孢子虫;Cp15基因;原核表达;鉴定 Analysis and tertiary structure prediction of CP15 antigen from Cryptosporidiumparvum and construction of GST fusion expression vector Abstract Ｃryptosporidiosis is a worldwide found parasitic disease caused by Ｃryptosporidium, which infects humans and many animals. Ｃryptosporidium is the major protozoan parasite in the phylum Apicomplexa, it causes watery diarrhea in infected individuals and can be fatal to immunocompromised individuals, e. g, AIDS patients. All infected organism will excret Ｃryptosporidium oocyst in feces, which can contaminate