鼠Hlx基因修饰树突状细胞系的建立及功能的初步的研究.pdfVIP

摘要 目的： 为探讨转录因子Hlx在树突状细胞中的作用，我们了构建携带小鼠 建立稳定过表达转录因子Hlx的小鼠DC2．4细胞株，通过一系列体外实 验研究过表达转录因子Hlx的树突状细胞株在生物学行为和功能的改 变，作为一种工具细胞株为进一步的研究奠定基础。 方法： 酶切筛选阳性克隆并进行序列测定。 G41 lag／ml 8筛选矛I]EGFP的表达，并经过单克隆化生长，获得稳定表达 Hlx的克隆株。 (3)应用real．time PCR的方法在转录水平比较不同细胞株DC2．4、 DC2．4／EGFP、DC2．4／Hlx中垧T-bet、GA TA3、lfn叫、jl一4、ll，l2p40、 弘，勿35、弘6的表达变化；再应用ELISA的方法在蛋白水平对不同细胞 株培养上清中细胞因子IFN一7和IL．12P70进行检测。 面分子的变化。 ’江蒸盘堂塑±堂焦迨塞 HcRed并且应用3％多聚甲醛固定处死的大肠埃希菌37。C共培养2h，同 时在4C做平行对照作为背景扣除非特异性吸附和设定LPSjliI]激组作为 阳性对照，FACS分析过表达转录因子Hlx对树突状细胞吞噬的影响。 mg／L的0VA刺激24h，然后30mg／L丝裂霉素37。C处理20分钟，预冷的 mmol／L 脏，应用MACS分离CD4+T细胞，3CFSE染色后备用。于24 板中每孔接种2×105个未标记CD4+T细胞和2×104个树突状细胞共培养， 三天后MTT法检测增殖。两组中均设空白和阳性对照。 结果： 切鉴定均与目的片段大小相符；序列测定结果显示与GenBank中 (NM008250．1)鼠Hlx基因序列完全一致。 DC2．4经G418抗性筛选得到抗性细胞株，经FACS，RT—PCR， 养上清中细胞因子IFN吖和IL．12p70分泌增加。 表达均增加，而TLR4表达水平很低且差别不明显，CCR7无表达。 姿苤盘鲎塑±鲎焦逢耋 激组则无十分明显改变。抗原提呈能力分析显示，DC2．4／Hlx可以更 有效地提呈抗原给T细胞，促进CD4+T细胞的增殖。 结论： (1)成功构建真核表达载体PIRES2．mHlx-EGFP。 胞系DC2．4／EGFP。 (3)功能研究发现，在未成熟树突状细胞系DC2．4中过表达转录 因子胁，可以促进IFN-丫的转录和表达，进而促使树突状细胞成熟， IL．12分泌增加，吞噬能力下降、抗原提呈能力增强，能够更有效的促 进同基因型来源的CD4+T细胞的分裂增殖。 关键词：mHlx，DC2．4，基因转染，过表达，抗原提呈 ABS’I‘RAC’I’ ective obj Inorderto theeffectofmHlxindendritic constructed study cell，we PIRES2．m日Z舻EGFP vectorandtransfecteditinto eukaryoticexpression celllineDC2．4．The cellline mousedendritic over—expressed月及dendritic was researchedthe of DC2．4}Hlxestablished．Onthis base，we change functionand ofDC2．4fHlx．In biologicalactivity addition，the