Gateway.pptx

Gateway 技术快速构建表达载体; Gateway技术是基于研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）建立的 。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白解离因子Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的重组位点和介导蛋白。;O—15bp的同源序列 attP—λ噬菌体同源重组位点 attB—E.coli染色体上的同源重组位点 ;修饰后的位点信息;Gateway技术只需要两步反应就可完成表达载体的构建。;第一步：入门载体的构建;BP 反应;第二步：表达克隆载体的构建（LR反应）;为什么要构建入门载体？;实例一[1];;OsAct1 (rice actin 1promoter and intron), PvUbi1 (switchgrass polyubiquitin 1 promoter and intron), PvUbi2 (switchgrass polyubiquitin 2 promoter and intron), ZmUbi1(maize ubiquitin 1 promoter and intron), bar (bialaphos resistance coding region), hph (hygromycin B phosphotransferase coding region), pporRFP (Porites porites red fluorescent protein coding region), GUSPlus (GUSPlusAM coding region along with the rice glycine rich protein signal peptide sequence),Cmr (chloramphenicol resistance gene), ccdB (negative selection marker), 35S T (35S terminator sequence), NOS T (Agrobacterium tumefaciens nos terminator sequence), OCS T (octopine synthase terminator sequence), AcV5 (epitope tag), LB (left border), RB (right border), R1 and R2 (attR1 and attR2 recombination sites), pUC ori and ColE1 (origins of replication in E. coli), PVS1 (origin of replication in A. tumefaciens), Ampr and Kanr (ampicillin and kanamycin bacterial resistance).;通过三个实验验证pANIC载体体系的效能;pANIC构建的含有gus基因的表达载体，转化植物后gus基因的表达活性。由图可看出， 含有玉米泛素蛋白ZmUbi1的pANIC过表达载体的GUS酶活性最高。;该图显示利用pANIC 4B载体(8B前体)构建的发卡RNA表达载体在柳枝稷中两个独立品系间的表达量， PvCCR1和PvC4H1 表达量明显低于对照组。;用pANIC 7A构建的表达载体，通过基因???技术导入小麦和柳枝稷中， 观察pporRFP红色荧光蛋白基因的表达。红色荧光蛋白自发荧光率较低 而且红光穿透力更强，最高吸收峰为583nm。;实例二[1];p1104D重组基因的选择性测试;优点;Gateway克隆技术是invitrogen公司的专利，通用性不如经典克隆强，对于本身含有重组类似或保守序列的片段或结构复杂的片段应用此法可能会受影响；而且BP反应和LR反应试剂较贵。;参考文献 [1] David G.J. Mann etc. Gateway-compatible vectors for high-throughput gene functional analysis in switchgrass (Panicum virgatum L.)and other monocot species [2]郭姗姗基，张蒙，单卫星。基于Gateway技术的植物表达载