Notch信号通路在缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用--杨桦要点详解.docxVIP

作者单位：400037 重庆，第三军医大学新桥医院普通外科， 通讯作者：杨桦， Email: hwbyang@126.com 基金项目：国家自然科学基金重点项目 (NSFC，国家自然科学基金面上项目(NSFC, 国家教育部创新团队项目基金 （教技函[2013]59号） Notch 信号通路在缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用 陈国庆，张治草，程应东、肖卫东，邱远，王文生，杜广胜，古应超，李祥生， 杨桦* *通讯作者 摘要： 目的：明确Notch信号通路在肠道缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用。 方法：建立雄性C57BL/6小鼠的肠道缺血再灌注动物模型，12h后取肠组织标本。TUNEL方法检测肠粘膜上皮细胞的凋亡水平。Realtime-PCR及Western-blot方法检测肠粘膜上皮细胞Notch信号通路各组分的表达变化。建立体外IEC-6细胞的缺氧/复氧细胞模型，通过阻断剂DAPT及siRNA技术明确Notch信号通路在肠粘膜上皮细胞凋亡中的作用。 结果：肠缺血再灌注后，小鼠肠粘膜上皮细胞的凋亡水平明显升高，与此同时肠粘膜上皮细胞内Notch信号通路Jagged1、DLL1、Notch2及Hes5的mRNA及蛋白表达水平均明显升高。在体外IEC-6细胞的缺氧/复氧模型中，缺氧/复氧刺激促进了IEC-6细胞的凋亡，而阻断Notch信号通路的表达后，IEC-6细胞的凋亡水平进一步明显升高。 结论：在肠道缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞中的Notch信号通路被激活，发挥抑制肠粘膜上皮细胞凋亡的作用。 1.前言 肠道的缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury, I/R）可导致全身炎症反应综合征、脓毒血症及多脏器功能障碍综合征。肠道是多脏器功能障碍综合征的“发动机”，而肠粘膜屏障功能的损伤被认为是其内在的始发事件[1]。既往研究已明确，肠道I/R可导致肠粘膜上皮细胞的凋亡，进而引起肠粘膜屏障功能的损伤[2-4]。信号通路PI3K/AKT，ERK1/2及HIF-1通路均参与了肠道I/R导致的肠粘膜上皮细胞的凋亡[5-7]。但是肠道I/R条件下肠粘膜上皮细胞凋亡的调控机制仍未完全明确。 既往研究明确，Notch信号通路在肠粘膜上皮稳态的维持中发挥重要调控作用[8]。在哺乳动物中，Notch信号通路组分有四种Notch受体（Notch1-4）、五种配体（Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4）[9,10]。配体与细胞膜表面的Notch受体相互结合，激活了Notch受体的酶切反应，Notch受体释放酶切后的活性片段NICD进入胞浆，NICD由胞浆进入胞核形成转录激活复合物，并激活相应的目的基因Hes家族及Hey家族基因[11]。γ分泌酶参与了Notch受体的酶切反应，抑制γ分泌酶的活性可抑制Notch受体的激活[12]。 研究发现，在肝脏的I/R损伤中，Notch2-Hes5信号通路具有抑制I/R损伤导致的肝脏细胞凋亡的作用[13]。另外，Notch信号通路可抑制损伤导致的心肌细胞、内皮细胞和淋巴细胞的凋亡[14-16]。Notch信号通路还可抑制I/R损伤导致的神经细胞及间质细胞的凋亡[17,18]。肠道缺血再灌注损伤后，肠粘膜上皮细胞发生增殖及凋亡反应[2-4]。在此前的研究中，我们发现肠道I/R损伤可导致肠粘膜上皮Notch信号通路的激活，参与了I/R损伤后肠粘膜上皮细胞的增殖[19]。然而，Notch信号通路是否参与了肠I/R损伤后肠粘膜上皮细胞的凋亡，尚不明确。本研究拟明确，肠道I/R损伤后Notch信号通路在肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用。 2、材料与方法 2.1 实验动物 本研究中使用C57BL/6小鼠、6-8周龄、雄性，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心。所有小鼠随机分为2组，对照组（n=7）及I/R实验组（n=7）。肠I/R小鼠模型的建立方法为微创血管夹夹闭肠系膜上动脉20min，之后松开血管夹关闭腹壁切口，12h后处死动物，取空肠组织备用[19]。 2.2 细胞培养 肠粘膜上皮细胞IEC-6购买于美国ATCC公司。IEC-6培养于DMEM培养基，加入10%胎牛血清，100ug/ml链霉素及100IU/ml青霉素。细胞贴壁后继续于常氧条件（20%O2,5%CO2）或缺氧条件下（1%O2，5%CO2）。需要阻断Notch通路激活时，培养基中加入DAPT干预12h，此后流式细胞学技术检测IEC-6细胞的凋亡水平。 2.3 Real-time PCR实验 Trizol法提取肠粘膜的总RNA，逆转录为cDNA后保存备用[32]。在体内实验中，具体引物序列如下：Jagged1，正