产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定.docVIP

2011届本科毕业论文（设计） 产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定 姓 名：____ _______ 系 别：__生命科学学院____ 专 业：___生物技术10-1___ 学 号：____100914051_____ 指导教师：____ _______ 2012年 10 月 31 日  产淀粉酶芽孢杆菌的筛选 1 实验意义 从环境中采集样品并从中分离纯化 2.1土样: 实验前三天在土壤5-8cm处埋馒头，实验前一天 2.2培养基的配方： 筛选培养基: 淀粉 10.0g，酵母膏2.50g，蛋白胨 5g，Na2HPO4 2.50g， MgSO4·7H2O 0.05g，NaCl 0.05g，琼脂 10.0g，水 500mL，pH7.0 － 7.4 2.3 器材：40个培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、 涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台 2.4试剂 2.4.1 淀粉酶活力测定：碘液 2.4.2革兰氏染色：卢戈氏碘液、95%乙醇、香柏油、乙醇乙醚 3 实验步骤 3.1 培养基的制备及其仪器的灭菌 3.1.1量取500ml水，按培养基配方比例依次准确地称取淀粉（先将淀粉用水搅成糊状）、酵母膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，加少量水熔解,再加入琼脂加热溶化，不行搅拌，最后补充水分，分装入试管内或三角烧瓶内，加塞包扎。 3.1.2试管中倒培养基约3ml，再和剩余培养基、平板、移液管用报纸包扎好，于121℃， 30分钟高压蒸汽灭菌。 3.1.3倒平板 将灭菌的培养基冷至50℃左右，在超净工作台上，试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。三角瓶中的培养基倒平板，约10ml，静置待用。 4.1 产淀粉酶菌株的分离、纯化 41. 1采集土壤样本：用塑料袋在预处理处取样 4.1.2 稀释 称取土样5g，放入盛有45ml无菌水三角瓶中，使土样和水充分混合加玻璃珠，摇约10分钟，制成土壤悬浮液。然后将菌悬液置于80℃水浴锅中，20min。用一只无菌吸管吸取0.5ml土壤悬浮液加入盛有4.5ml含有无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，依此稀释10-2、10-3、10-4、10-5几种稀释度的土壤溶液，分别编号为1、2、3、4、5。 4.2.1 初步筛选 4.2.1.1用稀释样品的同吸管分别依次从10-、10-、样品稀释液中，吸取mL于冷却凝固的平板上（每个梯度重复两次），用涂布棒涂抹均匀。记好编号。倒置于37℃温箱中培养小时培养小时后，取出平板，注入碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有圈，说明该菌能。挑取斜面上，培养 4.3.3.2 染色：滴一滴卢戈碘液于菌体上，染色一分钟，在水龙头下慢慢冲洗染液。 4. 3.33镜检：先用低倍观察，再用油镜滴加香柏油观察染色结果。菌体周围为紫色，内部有小部分无色，为芽孢。最后用乙醚乙酯擦净镜头。 观察结果： 24h菌体较小，基本无芽孢。48h后观察菌体形态较大，可以看清有芽孢的1和3号。60h后染色观察，菌体变大了。1和3及4号可见芽孢。 4.4 高活力淀粉酶菌株的筛选： 每染过一次后，就在菌落的周围滴加碘液，用尺子量取淀粉水解圈直径 24h 10mm 无 12mm 5mm 无 无 48h 无 8mm 14mm 12mm 10mm 19mm 60h 无 无 17mm 11mm 13mm 22mm 数据分析：“无”可能由于接种环过热杀死了菌体；还有菌体较小基本无透明圈产生。有数据可知1号菌株生长较好，且透明圈最大。 5、菌种保藏 将初步鉴定好的菌种斜面培养基试管收起，在37℃的恒温培养箱中培养。