基于“分段”“完整”转化的G―四链体脱氧核糖核酸酶传感器用于多聚核苷酸激酶的检测.docVIP

基于“分段”“完整”转化的G―四链体脱氧核糖核酸酶传感器用于多聚核苷酸激酶的检测 　　摘 要 采用“分段”转化为“完整”G-四链体脱氧核糖核酸酶的策略，构建了检测多聚核苷激酶（T4 PNK）的传感器。将形成G-四链体的富G序列PS5.M序列拆分成5′和3′端均为羟基的两条链：链S1OH和链S2OH，即分别具有12个碱基的“分段”的PS5.M。在ATP存在下，T4 PNK酶可以将链S2OH的5′端的羟基磷酸化，转化为S2P；在S1OH、S2P以及Helper链SH存在下，T4 DNA连接酶（T4 DNA Ligase）将链S1OH和链S2P连接成“完整”的PS5.M序列。在体系中再加入核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ），从SH的3′端剪切SH，释放出PS5.M。在K+存在下， PS5.M与氯化血红素（Hemin）作用，形成具有类过氧化物酶活性的复合物，催化H2O2氧化2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）的反应，通过检测氧化产物在418 nm处的吸收值变化，实现对T4 PNK活性的定量检测。线性检测范围为0.02～3.0 U/mL，检出限为0.014 U/mL（S/N=3）。对Hela细胞和HEK293细胞实际样本的T4 PNK活性进行了检测，平均回收率为95.6%～105.7%。 中国论文网 /8/view-7208982.htm 　　关键词 多聚核苷酸激酶； 脱氧核糖核酸酶； G-四链体； 生物传感器 　　1 引 言 　　T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）是Richardson于1965年研究T4噬菌体侵袭大肠杆菌的过程中发现的[1]。T4 PNK酶可以催化ATP的γ-位或3′-单磷酸核苷的磷酸基团与寡核苷酸链（双链DNA和单链DNA或RNA）的5′-羟基基团进行转移和交换，实现寡核苷酸的5′磷酸化或者3′去磷酸化，在基因克隆、载体制备和核酸的损伤与修复中具有非常重要的作用[2]。因此，发展快速、简单、灵敏的分析方法用于检测T4 PNK在核酸代谢和分子靶向治疗等研究领域具有重要的实际意义。 　　近年来，在放射性同位素32P标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影等传统检测方法[3，4]的基础上，发展了一些快速检测T4 PNK的新方法。这些方法主要基于分子信标技术[5]、发夹型荧光探针技术[6]、氧化石墨烯淬灭技术[7]、金纳米粒子显色技术[8]以及电化学检测[9]等，以实现对T4 PNK的快速检测。 　　1990年，通过体外筛选技术产生了第一个RNA酶，后来发现具有剪切RNA及连接DNA的DNA酶[10]，使DNA分子跨进生物催化的大门[11，12]。与蛋白酶相比，DNA酶具有合成简单、易于修饰及热稳定性好等特点，在生物传感器的研究中占有重要地位[13]。G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基G的DNA或RNA序列形成的特殊核酸二级结构[14]。研究发现，一些G-四链体DNA与氯化血红素（Hemin）结合形成的复合物，可以催化H2O2参与的反应，具有类过氧化物酶的活性[15，16]。G-四链体脱氧核糖核酸酶的这一特性已被广泛应用于多种分析物的放大检测[17～21]。本研究选用富G的DNA序列PS5.M为模型，其与Hemin结合后，可以催化H2O2氧化2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）的反应[22]，将其裂分为两条寡核苷酸链S1OH和S2OH，由T4 PNK磷酸化S2OH为S2P，与链S1OH和Helper-DNA链SH杂交后，在T4 DNA连接酶的连接作用下，形成PS5.M与链SH的双链结构，最后由核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）切掉链SH，释放链PS5.M。利用PS5.M与Hemin结合后形成DNAzyme，催化H2O2氧化ABTS的反应，通过检测体系在418 nm的吸光度变化，实现对T4 PNK 酶的定量检测。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Lambda 25 紫外-可见分光光度计（PerkinElmer公司） ，测量时使用微量样品池；Biophotometer 核酸蛋白仪（Eppendorf公司）；ChirascanTM-plus 圆二色光谱仪（Applied Photophysics公司）。 　　实验中所用到的寡核苷酸链：S1OH（5′-GTGGGTCATTGT-3′）、S2OH（5′-GGGTGG GTGTGG-3′）、PS5.M（5′-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG-3′）、5H8（5′-ACCCACACAA-3′）、5H10（5′-CACCCACACAAT-3′）、5H12（5′-CCACCCACACAATG-3′）、5H14（5′-CCCACCCACACAATGA-3′）、5H16（5′-ACCCACCCACACAATGAC