细胞培养技术详解.ppt

二、细胞生长曲线 （一）原理及应用 细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。通过此实验我们除了能够得到正常组织细胞、肿瘤细胞的生长规律外，同时我们还应用于体外药物敏感性的测定以及多种抑癌基因的研究。常用方法有细胞计数法和MTT法。 （二）操作步骤（略） 细胞学相关实验 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 （二）细胞培养操作 1 操作时用酒精棉擦手，装液体的瓶子外面也要用酒精棉擦拭后再放在超净台内。 2 物品摆放：酒精灯应放在操作者的正前方，废液桶和培养基等液体要放在酒精灯的两侧；并重新用酒精棉擦手。 3 用镊子挟取吸管、瓶塞等物品时先要在酒精灯上过火。 4 培养基、PBS等，打开瓶塞后最好倾斜放置，培养瓶开口后尽可能放在酒精灯的附近。 5 打开或盖上瓶塞时，瓶塞和瓶口都要在酒精灯上过火，烧瓶口时应对着火焰烧瓶颈。盖胶塞时应用旋转的方法，不要用镊子压胶塞的顶部，以免用力过大或受力不均打碎瓶子。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 6 吸管的使用：拿吸管用执笔的方法，吸管在酒精灯上过火时间不要太长，以免造成培养基中的生物活性物质和消化液中酶活性失效。吸过液体的吸管不能再在酒精灯上过火。吸管操作要稳，向培养瓶加液体时不要滴在瓶口或瓶外壁，以免造成污染。 7 如果培养两种以上细胞时要分批操作，避免交叉污染； 8 从培养箱取出培养瓶时应水平或瓶口上倾；往培养箱放培养瓶前，要检查瓶壁外是否有液体，如有要用酒精棉擦去。 9 培养箱要轻开轻关。培养箱水槽内水量要保持在总体积一半以上。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 10.以原代培养和传代培养为例介绍培养过程 原代培养：是指从组织中分离出细胞后在体外进行的首次培养。 原代培养的方法：组织块法和酶消化法。 原代培养的注意事项： （1）原代培养时一定将组织中的血管和外膜等除干净。 （2）组织块法时，组织不应过大一般剪成1mm3左右大小。然后将组织块平铺在培养皿上，先不要加培养液，放置15-30分钟后加入少量液体，24小时后再补加培养液。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 （3）采用消化法时，要将组织块剪成泥状，不同组织要用不同的消化液，消化液浓度和消化时间也不相同，如果培养的不是成纤维细胞，要采用差速贴壁的方法去除成纤维细胞。 （4）原代培养的细胞需要进一步纯化。酶消化法，机械刮除法等。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 传代培养是指原代培养的细胞增殖成单层后；或者是细胞铺满瓶底后；再或者是悬浮生长的细胞增殖到一定程度后，我们将其稀释，然后传到新的培养瓶的过程。 贴壁生长的细胞用酶消化法传代； 半贴壁细胞可直接吹打后分瓶； 悬浮生长细胞要先吹打再离心，然后将沉淀稀释分瓶。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 操作步骤： ⑴倒掉旧培养液 ⑵用平衡盐液（多用PBS）冲洗细胞后弃掉; ⑶加入消化液，要使消化液浸过细胞层面，然后弃掉; ⑷消化2-3分钟（禁止放入培养箱）; ⑸镜下观察，当细胞变圆变亮时应终止消化。胰酶消化时可直接加含有血清的培养基吹打细胞后分瓶；如用EDTA消化需用Hanks液终止，混合液需先终止后离心然后分瓶; 注意： 无论是在培养瓶中还是在离心管中操作都要用吸管吹打细胞，使其成为单个细胞悬液，然后均匀的分到两个瓶中。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 细胞培养中可能遇到的问题： 1.细胞不贴壁或少贴壁 2.细胞成团或分散不均匀 3.细胞生长缓慢 4.培养瓶中出现残渣 5.细胞污染（细菌、真菌等） 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 （三）无菌操作后 无菌操作结束后，将废液桶等物品取出，用酒精绵擦拭台面并将台内物品摆放整齐，关闭通风、照明，将台内紫外打开； 查看显微镜、离心机等设备电源是否关闭； 将掉到地面上的废弃物捡起，如果有液体撒在地面上，要用清水擦拭。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 （四）无菌室清扫 依据 科研实验中心《细胞培养间清洁规范》进行 安排值日 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 七、细胞冻存与复苏 （一）细胞冻存： 1.细胞冻存时机：贴壁率为85%-95%的对数生长期细胞。 2.冻存液：含有5%-7%二甲基亚砜的血清液 3.冻存要求：冻存前一天换液；冻存液中细胞的终浓度以1-5x106/ml为宜；冻存时温度应逐渐降低；首次冻存时应复苏一支观察其冻存效果。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 （二）细胞复苏 细胞复苏时应在37℃水浴锅中迅速融解，操作如下： 准备好培养液（预温）和离心管 将冻存管从液