聚丙烯酰胺凝胶电泳法医学系高玉振.pptVIP

* * 聚丙烯酰胺凝胶电泳 法医学系 高玉振 聚丙烯酰胺凝胶的合成、结构与性质 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide，简称Acr)和交联剂N1，N1-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构的凝胶。参与反应的催化剂有二种成分。一是引发剂，它提供原始自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应；二是加速剂，它加快引发剂释放自由基速度。表1是常用引发剂与加速剂的搭配。过硫酸铵和核黄素分别引发二种不同类型的反应。 丙烯酰胺，N’,N’-甲叉双丙烯酰胺和聚丙烯酰胺的化学结构式 表2 聚合反应催化剂的搭配 化学聚合 化学聚合 光聚合 TEMED DMAPN TEMED (NH4)2S2O3 (NH4)2S2O3 核 黄 素 引发反应 加速剂 引发剂 TEMED，N，N，N1，N1-tetramethy1ethylenediamine N,N,N1N1-四甲基乙二胺； DMAPN，3-dimethylaminpropionitrile,3-二甲基氨丙腈 化学聚合：过硫酸铵在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，进而使单体形成自由基，引发聚合反应。聚丙烯酰胺凝胺的分离胶(小孔胶)，就是通过这种化学聚合而合成的。 光聚合：核黄素在光下形成无色基，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。但过量的氧会阻止链长的增加。此法比上法制得凝胶的胶孔大，因此常作电泳中的浓缩胶。 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 为了使样品分离得快，操作方便，便于记录结果和保存样本，要求凝胶有一定的物理性质，合适的筛孔，一定的机械强度，良好的透明度。这些性质很大程度上是由凝胶浓度和交联度所决定的。 100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数称为凝胶浓度，记号为T。T(%)＝［Acr(g)+Bis(g)］/V(ml)×100% 凝胶溶液中，交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度，记号为C。C(%)＝Bis/(Acr+Bis)×100% 凝胶浓度能够在3%～30%中变化，浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；浓度太小，凝胶稀软，不易操作。凝胶浓度主要影响筛孔的大小。实验表明，筛孔的平均直径和凝胶浓度的平方根成反比。 聚丙烯酰胺凝胶的性能 制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如下优点： (1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制和调节。并且制备重复性好。 (2)聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳结构，没有或很少带有极性基因，因而吸附少，电荷作用小，不易和样品相互作用，化学性质比较稳定。 (3)凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果。且需要样量较少。 (4)用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。 由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定。 夹心垂直平板电泳槽示意图 凝胶模示意图 *