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细菌鉴定流程 细菌鉴定 细菌形态学鉴定 16S rDNA 鉴定 生理生化鉴定 细菌形态学鉴定 从-80??冰箱中取出菌株放4??复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。 放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28??培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。 3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。 4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，， 细菌 大小（mm）形状 干湿  透明度颜色  边缘 注意事项： 接种划线应在酒精灯旁边操作 培养时应倒置培养，防止污染 二、革兰氏染色 涂片固定 将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。 注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 染色 一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 加上碘液染色1分钟，水洗。 加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。 加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。 结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。 注意事项： ① 标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。 ② 玻片通过火焰温度不能太高。 ③ 碘液变透明，则不能使用。 ④ 水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。 三、16S rDNA 鉴定 （16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种） 1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定 3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。 4. 沸水浴10min，12000rmp离心2min，取1.5ul上清作为模板，上下游引物各0.5ul加到23ul体系中，每个样品做3个平行，进行PCR扩增。 注意事项： ① 使用离心机时一定要配平，防止损坏离心机。 ② 实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。 （若结果不理想则用改良方法） 1．收集菌体，或直接从平板上刮取细菌（直径约1.5-2mm左右大小菌落的菌量），加入含20ul 0.1-0.5% Triton X-100的200ul PCR管中，充分重悬。 2．对于较难散开的细菌则可采用500ul体积（同样含0.1-0.5%Triton X-100），使用超声重悬（菌体相应增加），处理后取出20ul加入200ul PCR管中。 3. 将上述PCR管置于沸水中水浴处理5分钟，短暂离心（约30s）后，取1ul作为模板加入20ul（或25ul）体系中，进行PCR扩增。 0.1-0.5% Triton X-100的配置： ① 30%储备液的配置 Triton X-100 1.41ml 0.1mol/L PBS(pH=7.3) 3.64ml 充分混合后，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀，备用。 ② 用前取该储备液稀释至所需浓度，取1-5ul储备液加入300ul双蒸水中。 普通PCR体系：（23ul反应体系） 50管×PCR体系配制 ddH2O 918.5ul 10×buffer 125ul dNTP 100ul rTaq 6.5ul 配制体系所用的200μl PCR管、1.5ml离心管、纯水、1ml枪头、200μl枪头、10μl枪头均需灭菌，且在无菌操作台中操作。 配制体系前先将50个200μl的PCR管放在冰盒上预冷。 取一个无菌的1.5ml离心管，依次将药品加入管中，在漩涡混合器上混合5~10秒。 每23μl分装入200μl PCR管中，放-20??备用。 使用体系之前先验证体系是否好用。 例如：取实验室已知菌加16s上下游引物进行PCR反应，电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。 注意事项： （1）10×buffer、dNTP、rTaq用完尽快放回-20??保存。 （2）无菌操作 PCR程序： 94?? 5min 94?? 30s 35个循环 55 ?? 30s 72 ?? 1 min 30s 72 ?? 1