E玫瑰花结实验重点分析.ppt

[实验内容] E-花环形成试验（同学操作） 一、外周血单个核细胞的分离 细胞来源：人外周血 分离的方法：聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心法 （2）离心后小心取出，可见管中的液体分以下三层，用尖头滴管吸出上下两层液体之间呈灰白色的单个核细胞层，移入另一试管中，用适量（约10ml）1640细胞培养液混匀。 淋巴细胞分离液 血浆、血小板、Hank’s液 红细胞 单个核细胞 多形核白细胞 1、人外周血单个核细胞（PMBC）的分离 （1） 抗凝血3ml + 1640细胞培养液 3ml （倾倒法混匀），用吸管吸取上述稀释后的细胞悬液（6ml）， 小心叠加于淋巴细胞分离液（3ml）上。注意保持两者分界面清晰！ 平衡后即离心（2500rpm，20min） 实验流程 肝素抗凝血及Hank’s液 淋巴细胞分离液 （2）离心后小心取出，可见管中的液体分以下三层，用尖头滴管吸出上下两层液体之间呈灰白色的单个核细胞层，移入另一试管中，用适量（约5ml）1640液混匀，洗涤一次。 淋巴细胞分离液 血浆、血小板、Hank’s液 红细胞 单个核细胞 多形核白细胞 （3）将上述单个核细胞混悬液离心（2000rpm，10min），弃上清，加入定量（约0.8ml，注意:加入量一定要准确!）Hank’s液混匀配成1ml的液体。 2 淋巴细胞计数 方法 PBMC悬液0.1ml+0.9ml 0.5-1%冰醋酸，混匀后滴加1滴 液体于细胞计数板上，在低倍镜下计数四大格单个核细胞总和。 计数原则 a. 偶见两个以上组成细胞团按单个细胞计算 b．压线细胞计左不计右，计上不计下 计数结果： （四大格细胞数和）×25000即待测细胞悬液的浓度（单位ml) 注意事项： i. 注入细胞板上的细胞悬液量要适量，不理想者重试. ii. 计数后计数板立即浸入水，以防细胞悬液变干；低倍镜镜头回收 E-花结形成试验原理 人外周血T淋巴细胞上能与绵羊红细胞结合的受体，称为E受体，即CD2分子或LFA-2 （淋巴细胞功能相关抗原-2） ；在一定的试验条件下，绵羊红细胞能与该受体结合形成以T细胞为中心，四周绕以绵羊红细胞的玫瑰花团，故称E花环形成试验。 花结 花结分类： Ea-RFC(效应T细胞)：正常值为15~35%。 E-RFC(总和)：正常值为60~80%。 意义： ①?? E-受体为T细胞所特有，是鉴定T细胞的重要标志之一，还用于T细胞的分离。 ② ?用于检测患者外周血中T细胞的比例及数目，间接反映患者细胞免疫功能。 3 E-花环形成 将计数后的细胞悬液用Hank’s液配成1×106 /ml，将剩下的约0.9ml细胞悬液，离心（2000rpm，10min）后弃上清，留约0.1ml压积细胞。 用0.1ml预先经SRBC吸收的10%小牛血清将上述压积细胞搓捻重新悬浮，而后加入0.2ml 1%SRBC，轻轻摇匀，37℃预温5min后离心（500-1000rpm，5min），4℃冰箱中放置1.5h。 4 固定、染色、镜检 固定：取出孵育后的细胞，吸弃部分上清，留约0.1-0.2ml，轻轻旋转、搓捻使细胞悬浮，滴加0.8%戊二醛0.1ml，混匀，4℃冰箱中放置15min。 涂片：取出上述细胞悬液后，再轻轻旋转、搓捻混匀，推厚血片。 干燥：自然凉干。 瑞士干片染色： ①???? 滴3~5滴瑞士染液，至盖满整个血片为止。 ②???? 约40秒后，加2~3倍蒸馏水，用洗耳球混匀。 ③????约3min后，用细流水冲洗，吸水纸吸干， 油镜下观察结果。 200 n E-RFC ×100% E花结形成细胞百分率= 镜检：计数200个淋巴细胞，周围粘附3个或3个以上SRBC的淋巴细胞为E花结形成细胞（即T细胞）。 ? *注意事项： 油镜使用后用擦镜纸拭干镜头，摆开物镜，收箱。 ???实验材料分配：（2人/组） 肝素管及淋巴细胞分离管 1支 /1组 细胞计数板 1块/2组 Hank’s液 1瓶/列 0.8%戊二醇 1瓶/班 1%冰醋酸 1瓶/班 绵羊红细胞 3瓶/班 流式细胞仪的细胞分析原理 实验报告 E-花结形成试验的原理、简要步骤、结果及其讨论。 T淋巴细胞转化实验 原理 淋巴细胞表面有有丝分裂原的受体。其中， PHA、ConA的受