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限进材料固相萃取―高效液相色谱在线联用检测牛奶中四环素类抗生素残留 　　摘 要 建立了一种限进材料固相萃取-高效液相色谱在线联用检测牛奶中四环素类抗生素残留的分析方法。利用原子转移自由基聚合法制备的限进型聚（苯乙烯-co-二乙烯苯）键合硅胶作为同时富集四环素类小分子和排阻蛋白大分子的固相萃取材料。经过限进萃取柱的净化和富集后，牛奶样品中的四环素类抗生素（土霉素、四环素和金霉素）被反冲进反相C18分析柱进行色谱分离和测定。牛血清蛋白在限进萃取柱上的洗脱率为96.0%，说明制备的限进材料具有很好的排阻大分子蛋白的效果。3种四环素类抗生素在牛奶样品中的加标回收率为88.3%～101.5%，RSD中国论文网 /8/view-7206860.htm 　　关键词 限进型聚（苯乙烯-co-二乙烯苯）键合硅胶； 固相萃取-高效液相色谱在线联用； 四环素类抗生素； 牛奶 　　1 引 言 　　四环素类抗生素是养殖业中常用的兽药和饲料添加剂，具有抑菌范围广、杀菌能力强、成本低廉等优点，但是近年来抗生素的滥用逐渐导致动物源性食品中的药物残留超标。长期食用含有四环素类抗生素的食品容易造成肝和肾脏的损伤，引发过敏和中毒反应，还会使牙齿变黄，严重影响到人类的身体健康[1，2]。为此国内外严格制定了食品中四环素类抗生素的最高残留限量（Maximum residue limits，MRL），中国要求水产品中土霉素、四环素和金霉素的MRL为100 μg/kg[3]，美国规定在牛奶中的四环素类抗生素总量（包括土霉素、四环素和金霉素）的MRL为300 μg/kg[4]；欧盟要求四环素类抗生素在动物肝脏、乳汁和鸡蛋中的MRL分别为600，100和200 μg/kg[5]。 　　目前，检测动物源性食品中四环素类抗生素痕量残留的方法包括液相色谱-质谱联用法[6～8]、高效液相色谱法[9～11]、毛细管电泳法[12]、酶联免疫法[13]等，其中高效液相色谱法（HPLC）由于具有分析速度快、分离效能高、适用范围广等特点而被广范应用，但是大部分方法都需要经过沉淀蛋白以及离线固相提取过程，分析时间长，而且容易造成样品损失。 　　对牛奶、体液等生物样品进行分析测定前，由于待测物质在样品中浓度低，且干扰物质较多，会对检测的准确度和精密度产生影响，因此需要对样品进行预处理。固相萃取（Solid-phase extraction，SPE）是一种常用的样品预处理方法[14，15]，其与液液萃取法相比具有适用范围广、有机溶剂用量少、选择性高和萃取材料可重复使用等优势。但传统的固相萃取材料容易使蛋白变性沉淀或对于生物样品中的蛋白质等大分子形成不可逆吸附，造成填料的堵塞和萃取性能的降低。为了解决这个问题，研究者发展了限进材料（Restricted access material，RAM），这种材料通过两种类型的排阻作用去除生物大分子，一种是利用亲水层造成阻隔作用的化学排阻，一种是依靠填料孔径限制的物理排阻，大分子物质可以在死体积或者接近死体积的情况下被洗脱排出，同时样品中的小分子物质能够进入填料内层被富集和分离。限进材料的这种特性使其能够在处理复杂样品时实现样品的直接进样分析，如果作为固相提取材料与其他仪器联用，可以简化实验操作，节省时间和人力，因此在样品前处理领域备受关注[16～21]。本研究以原子转移自由基聚合法制备的限进型聚（苯乙烯-co-二乙烯苯）键合硅胶作为固相萃取柱填料，通过条件选择，建立了固相萃取-高效液相色谱在线联用检测牛奶中四环素类抗生素的新方法。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），包括LC-20AD高压输液泵，SPD-20A全波长紫外检测器，7725i手动进样器，7060六通切换阀；XW-80A旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；LG16-C高速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；Luna C18（2）色谱柱（250 mm ×4.6 mm，美国Phenomenex公司）。 　　盐酸四环素（标准品，97.5%）、盐酸金霉素（标准品，97.5%）、土霉素（标准品，88.8%），均购自中国药品生物制品检定所；甲基丙烯酸缩水甘油酯（Glycidyl methacrylate， GMA）、二乙烯基苯（Divinylbenzene， DVB）、苯乙烯（Styrene， St）购自天津希恩思生化科技有限公司；乙腈（分析纯，天津市康科德科技有限公司）；牛血清蛋白（Bovine serum albumin， BSA，北京索莱宝科技有限公司）；牛奶购自当地超市。 　　Na2EDTA-McIlvaine提取液制备：1.86 g Na2EDTA，7.5 g Na2HPO412H2O和6.5 g C6H8O7H2O用水