蛋白质化学一级结构测定分析.pptVIP

氨基酸组成分析的步骤 目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括3个步骤，即： 最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或摩尔比。 4、氨肽酶法 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序 。 但由于氨肽酶的特异性 和对各种氨基酸水解速 度不同，结果往往不易 判断，在实际应用中容易 导致错误结论而少用。 （1）过甲酸氧化法 优点：能将巯基（-SH）和二硫键（-S-S-同时氧化成磺基，生成的磺酸基很稳定，肽链不再重新形成二硫键，便于肽链分离。 缺点：氧化过程中，同时将蛋氨酸的侧链氧化成亚砜，色氨酸的侧链也遭破坏。 （2）还原法 一般还需要加入8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍使蛋白质变性。在这种情况下，还原剂才能有效地作用于暴露的二硫键。 溴化氰（CNBr）与肽链中甲硫 （蛋）氨酸侧链的硫醚基发生反应， 生成环化的溴化亚氨内酯，此产物水 解后，产生高丝氨酸内酯，使蛋氨酸 羧基端的肽键断裂。 这一方法的优点是产率高（可达85%）、专一性强，故实际应用较多。 （二）C末端降解法 虽然建立在Edman化学法上的自动化N端 测序技术日趋成熟，但仍有不少问题需借 助C端序列分析来解决。 C端测序尤其适合于大规模生产时的质 量控制、N端封闭蛋白的分析以及DNA 探针的设计。 原理 基于与N端Edman降解类似的原理， C端分析采用化学试剂与蛋白质和多肽的α-羧基反应，反应后的C末端衍生物被切割下来，通过HPLC系统进行分离分析。一个完整的C端序列分析包括以下几个步骤。 (1) 活化 蛋白质和多肽C端的自由羧基与乙酸酐反 应生成混合酸酐，并进一步环化成聚噁唑酮， 然后再在硫氰四丁铵作用下转化为乙内酰硫脲（TH）。 而侧链上的羧基形成的混合酸酐则难以成环。 (2) 酰胺化保护侧链羧基 侧链羧基形成混合酸酐后，与哌叮硫氰酸盐（piperidine thiocyanate）进一步作用形成酰胺，以保护侧链。 (3) 烷基化 由于C末端环化成的TH衍生物较为稳定而不易被切割，因此产率不高。用溴甲基亚萘（Bromomethylnaphthylene）选择性地烷基化修饰硫原子，形成烷基化-乙内酰硫脲 (ATH)衍生物，裂解产率将大大提高.。 (4) 修饰Thr和Ser的羟基 蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完全，在N-甲基咪唑（N-methlimidazole，NMI）和乙酸酐的共同作用下，Thr和Ser上的羟基基本被乙酰化。 (5) 裂解和衍生 C末端的ATH衍生物在酸性条件下与硫氰酸盐反应而被裂解生成ATH-氨基酸，新的C末端自动形成乙内酰硫脲，而不必重新活化。 因此，整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活化，并修饰Asp和Glu侧链羧基，以及Thr和Ser的羟基。 C端蛋白质序列仪 C端序列仪一般由N端序列仪改装而成，其 基本结构与后者相似，两者不同之处主要在于: (1) 反应所用的试剂不同，因此两者不可兼容，否则极易堵塞管道。 (2) 在C端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中进行，切割下来的ATH-AA仅在转化腔内干燥和溶解后即进入HPLC系统分离分析。而在N端测序仪中，ATZ-AA需在转化腔中转化为PTH-AA。 到目前为止，C端序列可测l-10个残基，平均3-5个，一次测序需要的量比N端测序要大得多，至少需1nmol。 此外，因为不同的氨基酸的反应产率不同，所以，图谱的分析也比N端测序复杂。 Combining Analytical Methods for Protein Characterization 偶联：蛋白质和多肽的自由α-氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂偶联，与其紧挨的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。 裂解：在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基，得到ATZ-氨基酸。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的α-氨基，又可与PITC进行偶联反应。 转化：ATZ-氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液（25%）条件下可转化成稳定的PTH-氨基酸。 PTH-氨基酸的鉴定：可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。 该法一般一次连续能够测出20~50个氨基酸 残基的顺序，但一次连续能够测出多少个氨基 酸残基的顺序，关键在于