第八章基因工程分析.ppt

第八章基因工程及其在医药工业中的应用 第四节 目的基因制备和常用分离方法 一、已知基因的获得： （一）人工合成 ①根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。 ②适用于合成分子量较小的目的基因（100bp以内）。 （二）聚合酶链反应（PCR）P333图8-16 1、定义： 又称基因体外扩增；是在引物的介导下，通过变性、退火、延伸三步循环反应，体外快速的DNA特异性扩增技术。 2、PCR反应原理 模拟体内DNA复制过程，通过变性、退火、延伸三步反应的循环完成，靶基因的双链DNA变性为单链，特异的引物在退火过程中与单链DNA模板聚合，在靶DNA的指导下引物的3’末端延伸靶DNA的互补链，完成一个循环。理论上，每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，DNA分子扩增为2n； 高温变性：94℃，目的基因接连为单链，以作为扩增的模板； 低温复性：55～60℃，一对特异性引物分别与模板3’端互补结合； 适温延伸：72℃，延伸反应； 3、PCR产物特异性 ①模板序列：应使用纯度和浓度较高的DNA模板； ②引物：优化引物的设计 ③使用较高的退火温度，较少的循环次数； ④使用较低浓度的引物、酶和镁离子； 4、PCR反应体系 模板：DNA或RNA(逆转录合成cDNA) DNA聚合酶：Taq