基因工程新技术分析.ppt

其它应用：on系统检测胞内代谢物浓度 茶碱aptamer也可以和其结构类似物咖啡因 、黄嘌呤核苷酸结合 未来应用：针对特定代谢途径中的代谢物，筛选对应的aptamer，人工合成核酶+aptamer的基因表达调控元件，实现代谢途径中基因表达的动态优化调节。 A B C D F E E1 E2 E3 E4 E5 E6 ON 系统 A, E2 B, E3 C, E5 OFF 系统 E, E6 D, E4 ☆ 4.2 蛋白质水平的基因抑制 抗体微量注射（效果不持续） 抗体的细胞内表达(抑制内质网和高尔基体中的蛋白效果好） 一般构建抗体的一部分肽链如:scFv ☆ * Holliday 交叉(Holliday Juncture/Junction)是以英国生物学家Robin Holliday的姓氏命名的一种发生在DNA分子之间的交叉(Crossing-Over)结构。 1964年Robin Holliday推测，参与同源重组的DNA分子之间通过形成“交叉”作为中间体，并造成彼此之间的交换。后来这一推测得到证实，因此，同源重组DNA分子双方的交叉被定名为Holliday Juncture/Junction。 RecA负责催化“链交换”，形成“交叉”，之后，可以利用其“分支迁移”催化活性稳固所建立的“交叉”，之后RuvAB的解旋酶活性可进一步促进“交叉”向纵深方向移动，形成更加稳固的“十字交叉”，RuvAB可推动”Holliday交叉沿整个基因组分子移动（原核）。Holliday交叉又包括两种形式，一种是“十字交叉”，一种则是“T交叉”（Three-way Junction)。 Holliday交叉必需得到精确的拆分，否则会妨碍DNA分子向子代细胞内的分配。ruvC 核酸内切酶 将holliday 结构切割拆分，最后在连接酶作用下连接完成重组。 * * sacB系统的缺点是片段较大（3KB)，而且sacB自发突变容易干扰结果。 后两个系统对宿主有特殊要求（缺陷型） * 如何判断位点的方向，看中间的8bp序列 * E :大片段颠倒（3KB),注意两个MARKER不能消掉，呆在染色体上了。 * 反义RNA的调节方式在细菌中普遍存在，在少数真核细胞中具有这种机制。 对于较大的动植物细胞也可用基因枪直接注入合成好的反义RNA，但效果是临时性的，不具有持续性。 * * 扩散性：例如植株的树叶中某个基因沉默，没有发生沉默的植株被嫁接后，生长一段时间嫁接体的树叶也发生基因沉默。 * 环1和环2在三级结构中有相互作用，这对锤头核酶的活性很重要 * Synthetic aptamers are generated through in vitro selection or Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) processes * yeast * 抗体在内质网中更稳定，内质网与细胞膜有联系，因此使用抗体表达的方法抑制细胞表明蛋白的效果较好。 对于多聚体蛋白质的失活，让其其中一个等位基因突变即可，这样形成的多聚体大多没有功能。 upp cat A B C MCS bla A C Single crossover Growth on MSM medium containing 20 ? M 5 FU C region recombination A region recombination A B C A C Wild type Markerless B konckout Step 3 也可利用二次单交换同源重组进行等位基因置换 IV 其它无痕操作技术 Using this method, Kolisnychenko et al. deleted 0.37 Mb of E. coli DNA consisting of cryptic prophages, transposons, damaged genes and genes of unknown function. This strain MDS12 resulted in a 8.3% reduction of genome content SceI + recA 重组系统： 设计PCR产物（含酶切位点 ?red同源重组 诱导SceI表达 recA重组修复 4. 基因抑制技术 4.1 核酸水平的基因抑制 （1）反义核酸技术 （2）共抑制 （3） RNA干涉 （4）核酶构件 （1）反义核酸技术 正义链 反义链 反义技术：根据碱基互补原理，表达天然的或人工合成的与特定基因互补的反义核酸（R