总RNA的提取和RTPCR分析.pptVIP

从组织中提取RNA则要注意： 动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿 组织器官的冲洗液 关于RNase酶 RNA易被RNase水解，RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中 RNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键 RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。 Rnase不需要二价阳离子激活 常用的RNA酶抑制剂： 焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性。（实验准备阶段使用） 异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用） 本次试验使用的试剂盒 主要内容 RT-PCR原理 RT-PCR步骤 常见问题分析 一步法RT-PCR RT-PCR主要用途 分析基因的转录水平 获取目的基因 合成cDNA探针 【实验器具】 离心机、冰盒、口罩、手套、EP管架、超净工作台、移液器、DEPC处理过的枪头、EP管等。 【试 剂】 5×M-MLV RT Buffer、 2.5mM dNTP mix 、 RNase抑制剂(30U/μL)、M-MLV Reverse Transcriptase、Oligo(dT)18 primer、DEPC处理过的水等。 RT反应体系： RNA (模版) dNTP mix(10mM) （底物） Oligo(dT)18或者随机引物 （引物） RNase抑制剂 M-MLV RT Buffer (缓冲液) M-MLV Reverse Transcriptase （酶） RNase free H2O RT反应条件： 70℃ 5min 打开二级结构 Ice 2min 退火，便于引物与RNA结合 42℃ 50min cDNA聚合 95℃ 5min 再变性使引物脱离模板RNA 和cDNA第一链，灭火MMLV 本次实验所选试剂盒 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。 该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 原 理 mRNA 5’ 3’ AAAAAAAA Poly(A)*尾 T T T T Oligo(dT) Super RnaseH- Reverse Transcriptase T T T T AAAAAAAA mRNA cDNA T T T T cDNA 3’ 5’ 5’ 3’ PCR扩增 …… 两步法RT-PCR Super RnaseH- Reverse Transcriptase 3’ 5’ T T T T cDNA T T T T cDNA …… PCR扩增 5’ 3’ mRNA AAAAAAAA Poly(A)*尾 3’ 5’ 3’ 5’ 大量样品分析 定性 检测多种目的基因 半定量RT-PCR 适用 特异性和灵敏度高 PCR扩增失败时便于分析原因 优点 GSP Oligo dT，随机引物，GSP 引物 一步法 两步法 两步法与一步法RT-PCR比较 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 （一）反转录酶的选择 随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Po