流式细胞术的原理及应用概要.pptVIP

流式细胞仪特点 FACS Calibur BD LSR FACS Vantage DiVa FACSAria 流式细胞仪检测范围 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 流式细胞术发展简史 1934年，Moldavan开创流式细胞自动计数的基础。 1950s，Coulter公司设计细胞自动计数器，初步解决了流动细胞的通路问题。 1965年，在细胞分选中应用了超声震动器。 1969年，Stanford、California大学的研究组发明了第一台较满意的流式细胞仪。 1972年，FACS-?型仪器试制成功，并在美国建国200周年纪念会上与人造卫星并列展示。 FCM的工作系统 1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞悬液。 2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。 3.数据处理系统： 对实验数据分析、存储、显示。 具有智能化、自动化特点。 流式细胞仪仪器结构 液流系统 光学系统 　　激光光源 　 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统 光学系统 入射光系统：激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。 发射光系统：散射光和荧光 光收集系统是由若干组透镜、滤波片和小孔组成,将产生的光信号引导至检测器 入射光—激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm、355nm和407nmUV激光 最多检测13个荧光参数 发射光 散射光信号 前向散射光（foword scatter, FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。 侧向散射光（side scatter， SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。 荧光信号 散射光 细胞分选系统 信号检测--荧光信号 光路——荧光信号 每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长，流式细胞仪利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。 长通滤片——允许长于设定波长的光通过 短通滤片——允许短于设定波长的光通过 带通滤片——允许一定带宽—波长的光通过 二向色性滤片——当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 荧光信号 荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 流式细胞仪的电子系统 进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析 流式细胞仪数据分析（1） 流式细胞仪数据分析（2） 流式细胞仪数据分析（3） 流式细胞仪的应用 临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干细胞移植监测、 HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 抗体的选择 首选直接标记抗体 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 使用双标以上抗体必做荧光补偿 光谱交叉 荧光补偿方法 流式细胞术样品制备的要求 制备单细胞悬液是流式细胞分析的基础。 标本应新鲜；采用密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，在分离和洗涤过程中应避免高速离心而致细胞膜结构破坏。 常用溶血剂处理红细胞。 温度和pH：25-370C，pH 7.0-7.2。 制备实体组织标本的单细胞悬液时多采用机械法，而少用化学法或酶消化法。 被检细胞或颗粒大小0.2－80um 样品中至少20000个细胞，浓度105-107个/毫升 实验对照的设计 空白对照： 阴性对照： 常用同型