原代细胞培养技术方案.pptVIP

（二）悬浮型： 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 常用分离方法 常用分离方法 血液细胞 梯度密度离心法 免疫磁珠法 流式细胞分选法 机体组织 组织块直接培养法（机械法） 酶消化法 胰酶 胶原蛋白酶I、IV等 梯度密度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 常用的试剂：淋巴细胞分离液、Ficoll-Paque等 免疫磁珠法 流式细胞分选法 血液细胞分离步骤 组织细胞分离步骤 细胞的培养和冻存 细胞生长曲线 细胞培养密度 冷冻保存要点 （1）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到 -3℃速度降温，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存 （2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 （3）细胞浓度控制在：1×106－1×107/ml。 （4）使用高浓度血清（30%） （5）使用合适的细胞冷冻保护剂（DMSO、甘油） 细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂（5-10%，培养基（60%），血清（30%）。 冷冻保存细胞的解冻与复苏 （1）快速解冻 （2）解冻操作过程动作要轻 特别注意： 解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免冻伤 冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染 无血清培养基 无血清培养基的应用 免疫细胞治疗 干细胞治疗 CHO细胞体系 特殊细胞培养：神经干细胞等 典型原代细胞分离示例 小鼠胚胎神经干细胞的分离示例 小鼠骨髓间充质干细胞分离示例 人脐带内皮祖细胞的分离示例 酶消化法 总结 无菌操作 环境、器材、实验操作 培养基 有血清培养基 无血清培养基 特殊培养基 分离方法 细胞鉴定 形态、存活率、功能 冻存复苏 Yrgene Primary cell solution Cryopreserved at early passage Cells are frozen at P1 through P5 Early passage material ensures higher viability and optimal plating efficiency Performance tested Media, kit supplements and reagents are tested for optimal reliability Growth and morphology are assessed to ensure all components work synergistically Quality controlled to ensure safety, purity and functionality Sterility test-bacteria, yeast, fungi and mycoplasma Viral test-HIV, HBV,HCV Viability and growth Staining-cell specific marker expression * * 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 * 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 2014全国分子细胞生物学实验技术培训班 WELCOME Website: 2015暑期分子细胞生物学实验技术培训班 理论 原代细胞培养技术与应用 主讲人：许澎 定义和分类 重要性 常规方法 注意事项 示例 第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 原代培养? （primary?culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 ?? 细胞系 （cell?line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖? ? 细胞株 （cell?str