原核生物的基因表达与操作技术方案.ppt

* * Gel: PhastGel? Gradient 10–15 Sample Dilution pretreatment: 1:5 with 15% SDS, 30% 2-mercaptoethanol,  10 mM Tris, 1 mM EDTA Sample volume: 1 μl Staining: Coomassie, according to the manufacturer’s standard protocol Instrument:: PhastSystem? Column: Superdex? 75 HR 10/30 (VT: 24 ml) Sample: 0.2 ml purified and refolded N-terminal (His)6-tagged recombinant protein eluted from HiTrap? Chelating 1 ml Buffer: 0.15 M NaCl Flow rate: 0.5 ml/min Fraction volume: 1 ml Instrument: FPLC?System Solid-Phase (or Matrix-assisted) Refolding IB in E. coli IB(solid) Solubilized IB (unfolded) Aggregate Refolded Bioactive monomer Refolding Solution-state F Solid Support Functional Group Solid-state refolding Remove Denaturant F 5.分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。 体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。 复性过程中的添加剂 低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。 盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是有效的促进剂。 In-Vitro Refolding Pathway S S S S Unfolded Aggregate Intermediate (molten globular) 3D Structure (Bioactive) S S S S Correctly Folded Intramolecular Misfolding S S S S S S S S S S S S Intermolecular Misfolding Standard IB Renaturation Process Cell Disruption Refolding Post-refolding purification step IB Isolation IB Washing Solubilization Centrifugation Remove Cell Debris Denaturant Partial Removal of Denaturant Complete Removal of Denaturant IB Dissolved Refolding 包涵体分离纯化过程 * 细胞培养 收获细胞 细胞破碎 离心 5 - 10 000g 沉淀物 冲洗和离心 分离包涵体 亲和纯化和复性 溶解 包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离 每 100 ml 培养液重新悬浮细胞沉淀物於 4 ml 20 mM Tris? -HCl pH 8.0 在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在+4oC下高速离心 10 分钟 重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含 e.g. urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡 并在+4oC下高速离心 10 分钟 用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物 * 2 M UREA 20 mM Tris HCl 2% Triton X100 0.5 M NaCl 溶解和准备样品 重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶解缓冲液 (e.g.): 20 mM Tris? -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8 * 在室温等 30-60 分钟 在+4oC 离心 15 分钟 用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜过