研究生课程分子生物学基本操作技术技术方案.ppt

我们课题组克隆基因的基本策略 通过大规模的测序，获得七鳃鳗的某个组织（如肝组织，髓组织）的EST（序列表达标签）库。EST，即某个基因的中间一段序列。 根据EST序列，设计引物，通过3’RACE和5’RACE获得该基因的全长序列。 根据全长基因的两端序列，设计引物，将该基因从七鳃鳗的cDNA文库（提取总RNA并反转录PCR获得）中钓取出来。 将该基因构建到原核或者真核表达载体，进行后续实验。 预祝所有研一新同学度过美好而充实的三年研究生时光！ * * * * * * PCR中应注意的事项 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 二、PCR技术主要类型 PCR技术的主要类型 1、反向PCR 　 6、锚定PCR 2、不对称PCR 7、原位PCR 3、RT-PCR 　　　　　　 8、重组PCR 4、差异显示PCR　　　　 9、免疫PCR 5、实时定量PCR　　　　10、多重PCR RT－PCR 反转PCR （RT-PCR）是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应，用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性，克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 PCR技术应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 细菌转化与目标DNA分子的增殖 一、细菌转化 二、细菌转化方法 三、克隆的筛选和鉴定 一、细菌转化 细菌转化（Transformation）: 一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学的处理，以增加它们获得DNA的能力。经历这种处理的细胞被称为感受态细胞（Competent Cell）。 1、常用细菌转化的方法------CaCl2法 将快速生长中的大肠杆菌置于经(0℃）预处理的低渗氯化钙(0.1mol/L)溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源DNA粘附在细胞表面。 42℃下做短暂热刺激，细胞吸收外源DNA。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂布于选择性培养基中分离转化子。 二、细菌转化方法 CaCl2法制备感受态细胞及转化过程：细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形 ，制成感受态，经42℃短时间热冲击处理能提高转化的效率。 其中的钙离子的作用机理（假说）： （1）改变了细胞壁的通透性（用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通性） ：使细胞壁局部原生质化，增加细胞壁的通透性 （2）改变了细胞膜的通透性 低温的CaCl2溶液中 ，（1）Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构 ，当42度热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。（2）促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，同时Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上 三、克隆的筛选和鉴定 1、抗生素 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。 2、α-互补蓝白斑筛选法 实验室常用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。 细菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程 RNA基本操作技术 （Techniques for RNA Manipulation） 一、 总RNA的提取 二、 cDNA的合成 RNA存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。 由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，为了研究RNA所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（Complementary DNA，cDNA)，再插入到可以自我复制的载体中。由于cDNA来自RNA，几乎不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离到相关基因。 一、 总RNA的提取 细胞中的总RNA包括信使RNA (mRN