硬脂酸镁的微生物限度检查重点解读.docVIP

硬脂酸镁的微生物限度检查 概述 本报告按USP31中“〈61-62〉非灭菌产品的微生物学检查”的规定，对硬脂酸美的微生物学检查方法学考察。参照企业提供标准，通过测试实验制定适合于本品的微生物学检查的方法。 企业提供标准： 总需气菌数（TAMC）不得过1000 cfu/g；霉菌及酵母菌总数（TYMC）不得过500 cfu/g；每1g样品不得检出大肠埃希菌；每10g样品不得检出沙门氏菌。 方法学 培养基及试剂 实验用培养基及缓冲液均符合USP规定。 BP：pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液 CA：溴化十六烷基三甲铵 MCA：麦康凯琼脂 MCB：麦康凯肉汤 MSA：甘露醇盐琼脂 RVS：RV沙门菌增菌肉汤 SDA：沙氏葡萄糖琼脂 SDB：沙氏葡萄糖肉汤 TSA：大豆胰酪胨琼脂 TSB：大豆胰酪胨肉汤 XLD：赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 实验菌株 黑曲霉 ATCC16404 枯草芽孢杆菌 ATCC6633，CMCC(B)63501 白色念珠菌 ATCC10231，CMCC(F)98001 大肠埃希菌 ATCC8739 铜绿假单胞菌 ATCC9027 霍乱沙门氏菌 ATCC14028 金黄色葡萄球菌 ATCC6538，CMCC(B)26003 本实验取用中国临床医学菌种保存中心（CMCC）的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌。这三株菌也来源于ATCC。实验用菌株，自种子批启用传代不超过5次。黑曲霉为3个月内制得的4℃保存的孢子悬液，可直接稀释使用。参照表格2，将其他6株菌分别接种至规定的培养条件培养。上述各菌分别以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10倍稀释至大约50-100 cfu/mL的浓度，备用。参照表格2各菌株的生长条件，采用浇碟法测定稀释得到的最终菌液浓度。 方法学 本部分主要包括培养基特性测试和方法的适用性考察。 3.1 培养基特性测试 按照USP31中“〈61-62〉非灭菌产品的微生物学检查”的规定，与已经通过测试验证的参比培养基（MⅠ）相比，当微生物限度检查用培养基（MⅡ）符合以下标准，则用于硬脂酸美的微生物学检验： 固体培养基的促生长能力：与MⅠ相比，MⅡ的回收率应在50%-200%之间。 固体培养基指示能力：与MⅠ相比，规定菌株在MⅡ的生长特征应与之类似。 液体培养基促生长能力：与MⅠ相比，规定菌株在MⅡ有明显浑浊。 抑制能力：无论是固体培养基或是液体培养基，规定菌株在其不得生长。 对于固体培养基，通常采用平皿计数法(包括浇碟法和表面接种法)来评价培养基特性，每次平行测试两皿，最后取平均数为计算结果。培养基特性测试结果见表格3-表格5。 3.2 方法适用性 当微生物学检查方法符合以下要求时，说明该方法适用该品种： 样品供试液不得抑制测试菌株的生长。计数实验中，测试微生物在供试样品中的回收率不得低于接种量的50%；控制菌检查中，测试菌在含有规定量供试品的环境中应可以生长。 样品自身含有的微生物水平不得干扰菌株回收实验。 供试液制备： 以70%的乙醇擦拭供试品的外包装，使自然挥干。由于硬脂酸美是一种脂溶性物质，因此用表面活性剂吐温-80将其溶解。无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入一定量的45℃灭菌的含1%吐温-80的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，振摇使分散均匀，制成1:40的供试液。 计数方法适用性： 实验组：取4个直径为9cm的无菌平皿。其中两个平皿中加入1:40供试液4mL和50-100cfu 测试菌，取另两平皿加入1:40供试液2mL和50-100cfu测试菌。每个平皿倾注45℃表格2中的规定培养基，摇匀。待琼脂凝固后，参照表格2的条件倒置培养。5株测试菌（黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）均进行该测试。 样品组：取8个直径为9cm的无菌平皿。其中两个平皿中分别加入1:40供试液4mL和2mL，每个平皿倾注45℃ TSA；取另两平皿加入1:40供试液4mL和2mL，每个平皿倾注45℃ SDA；各平行测试两皿。参照表格2培养。记录平皿计数结果，计算测试菌回收率。 菌液组：计数方法适用性检查中测试菌包括5株测试菌，分别为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。参考表格2培养条件，采用浇碟法计数，确定接种量。 回收率计算公式如下： A-实验组平均菌落数；B-样品组平均菌落数；C-菌液组平均菌落数。 控制菌测试方法适用性： 大肠埃希菌 预培养：取1:40供试液40mL（相当于1g）至400mL灭菌TSB，混匀，置30至35℃培养18至24小时。 阳性组1：接种50-100cfu大肠埃希菌至灭菌TSB中，置30至35℃培养18至24小时。 实验组1：取1:40供试液40mL（相当于1g）和50-100cfu大肠埃希菌至400m