在由温度引起的谷氨酸棒状杆菌分批和连续培养中谷氨酸合成和分泌通量的动态重点解读.docVIP

在由温度引起的谷氨酸棒状杆菌分批和连续培养中谷氨酸合成和分泌通量的动态分析 摘 要 在2262种谷氨酸棒杆菌菌株中，当触发谷氨酸，生长速率迅速下降.为了更好的获得对控制该代谢转变因素理解，发酵动力学进行温度敏感株种和葡萄糖限制持续培养。对于在33℃非分泌细胞，提高生长速度，导致中央代谢通量增长强劲，但胞内谷氨酸水平在氧代戊二酸节点酮戊二酸脱氢酶复合体（ ODHC ）活性和磁通分布本质上仍常数。当温度升高至39℃，代谢活性，谷氨酸合成异柠檬酸脱氢酶分裂28 ％至90％同时增长率的降低，使细胞活化能力合成谷氨酸大容量导出系统 关键词谷氨酸棒杆菌，谷氨酸代谢通量 由谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸是主要的工业发酵过程。为了达到高滴度生产率，发酵操作激烈谷氨酸生产阶段提供一个快速初始生长期。氨基酸分泌历来由生物素限制培养基诱导，或通过加入存在去垢剂或抗生素。必不可少的一个高生产率的过程是快速生长的细菌迅速过渡到消耗糖高效地转化为谷氨酸排出体外。，尽管越来越多的在遗传学，生理学和谷氨酸棒杆菌的代谢研究，谷氨酸生产相关机理还没有被确定。然而，在高产菌株几个相互关联的生理和代谢的修改进行了论证 通过所有的触发过程修改是.谷氨酸出口是被假设成一个特定的运输系统，其通常归因于细胞膜或细胞壁的属性的参与中央代谢网络酶活性的改变代表第二类型的生理变型。最重要的是在酮戊二酸脱氢酶复合体（ODHC）催化的2- 酮戊二酸为琥珀酰- 辅酶A氧化脱羧的活性下降 当加入青霉素或洗涤剂并在温度触发的细胞生产谷氨酸棒杆菌细胞中主要的生理改装在细胞内谷氨酸浓度的一个重要的减少。如谷氨酸代谢必不可少的中间体也被发现施加在中心代谢如PEPC和GDH的酶强反馈规定，这减少谷氨酸含量可被假定为强烈地影响细胞的比率增长和谷氨酸合成。 代谢通量调控的关键节点的再分配被认为是在谷氨酸分泌诱导修饰。第一通量为己糖磷酸途径和- 迈耶霍夫通路之间，从而使细胞，以满足NADPH不同的时间需求。据报道另一个关键通量再分配，发生在氧化戊二酸节点，它表示通过三羧酸循环谷氨酸合成和能源生产的代谢分支点。而在生长的细胞中，异柠檬酸磁通估计为75％三氯乙酸和25％的谷氨酸盐，在分泌细胞中，磁通分流被认为是80％谷氨酸盐显然，在谷氨酸流出，ODHC活性，细胞内谷氨酸含量，并在代谢转变发生代谢通量分布的所有这些报告的修改是密切相关的。但事件之后的触发过程的确切序列尚未阐明。。 本研究旨在获得的生理和代谢活动的温度敏感型谷氨酸棒杆菌菌株诱导谷氨酸一个更好的定性和定量的。，在所有情况下，我们比较了葡萄糖的摄取，细胞生长，谷氨酸盐和乳酸排泄的特定比率的变化，连同ODHC和谷氨酸盐的胞内水平的变化。利用代谢通量分析，材料和方法细菌菌株 培养基和培养条件。 所使用的菌株谷氨酸棒杆菌2262 ，由的-淀粉SA提供。培养基的组成是基于柠檬酸代替去铁胺MCGC介质。该培养基含有60克/升葡萄糖和15克/升连续培养葡萄糖。聚丙二醇作为消泡剂。将接种物在33 下在补充有NaHPO4 （3.8克/升）和脲（ 0.39毫克/升）的MCGC培养基中生长在摇瓶培养。葡萄糖浓度为34克/升，用NaOHpH值设定在7.6 。谷氨酸棒杆菌的过夜培养物用于接种的3升含有1.5升改MCGC介质的生物反应器（ ，荷兰）。在分批培养中，培养温度从33提高到39 C，培养4小时后，细胞指数生长期。连续培养开始，葡萄糖耗尽培养物MCGC，温度从33提高到39 。 NH3 12 N将pH设定点调节在7.6搅拌设定在1200转避免氧的限制。 胞外浓度，采集样本，以确定生物质和谷氨酸的浓度。通过570nm处的吸光度（分光光度计）测定细胞浓度，并通过直接称重法，以避免由于细胞形态的变化。样品离心（13000转，5分钟，公司）后，一个样品的胞内谷氨酸浓度的细胞从500和1 - 溴庚烷（1.07比重）培养基作为分离层和250混合物64000·G，5分钟和4 ℃ ），将沉淀的细胞用冷冻/解冻过程的3个周期在酸层被进一步破坏，将所得的萃取液通过加入5M的KOH中和。通过离心（32000·克和4℃）得到的上清液用于细胞内谷氨酸测定。衍生化后，用HPLC法（休利特帕卡德1090型，法国ULIS，法国）测定了ODHC分析从培养物中收集的细胞在氯化钾（2克/升）洗涤两次，再悬浮于N-三（羟甲基）甲基-2- 氨基乙烷含有30％（体积磺酸（TES）- 氢氧化钠缓冲液（100mM，pH值7.7）/ v）甘油。细胞在治疗过程中保持在冰中，通过超声破碎（40千赫，8个周期的30和60秒间隔出），并通过离心在44 15分钟后10，000·克。无细胞提取液在PD10凝胶柱（LKB-Pharmacia）上过滤。该ODHC测定采用和- 德- EDA的方法。内源性活性定量无1542-酮戊二酸