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定量一站式问题 汇报人：贾彦军 主要内容 1. RT-PCR基础知识 2.RNA提取要点 3.逆（反）转录注意事项 4.Qreal time –PCR 分析 PCR基础知识 PCR 定量PCR实时荧光定量PCR RT-PCR 定量PCR的原理 定量PCR的用途 定量PCR的基本流程 用途 GWAS 流程 实验设计 引物设计及合成 结果整理 数据分析 Real time-PCR 反转录cDNA 基因组DNA去除 Total RNA 提取 Total RNA提取 1.样品的保存 2.试剂的选择 3.操作的细节 4.RNA质与量的检测及保存 样品的保存 试剂的选择 广谱RNA提取试剂 小RNA提取试剂 体液RNA提取试剂 体液miR-RNA提取试剂 病毒、细菌、多糖多酚植物RNA提取试剂 操作 速度质量 全程低温（cen） 液氮使用 器械耗材准备 个人防护 实验环境 手法得当 DEPC 快、冷、准、细 细节决定一切 操作细节 细节总结 RNA RNA质与量的验证 浓度 完整性 纯度 琼脂糖凝胶电泳（TBE） 沉降系数 紫外分光光度计、荧光光度计 反转录注意事项 加样（顺序、预混、低温、涡旋、离心） 上机（程序、位置、手法） cDNA的保存（-20℃、 -80℃ ） Q real time-PCR 试剂选择与保存（Syber ddH2OPrimer） 操作要点 结果分析 注意事项 试剂保存 Syber GreenⅠⅡ/FAM: 4℃、-20 ℃、-80 ℃（白色沉淀处理） ddH2O Primer(稀释、保存、顺序、量) cDNA (用量选择适当—决定Ct值) 结果分析---扩增无峰值 扩增有杂峰 扩增有杂峰 填充好的 Needleman-Wunsch 表格 扩增有杂峰 欧洲生物信息学研究所BLAST服务器的用户界面 扩增有杂峰 扩增有杂峰 扩增效率有异常 注意事项 不经一番寒彻骨 哪得梅花扑鼻香 天道酬勤 众志成城 衣带渐宽终不悔 为伊消得人憔悴 请提出宝贵的改进意见！ * * * *