抗肿瘤药效.ppt

抗肿瘤新药的主要 药效学和毒理学研究 李 波 中国药品生物制品检定所 国家药物安全评价监测中心 新药的开发过程 抗肿瘤药物分类 (1)细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等 (2) 生物反应调节剂(biological response modifier) (3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent) (4) 肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer) (5) 肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor) (6) 分化诱导剂(differentiation inducing agent) (7)生长因子抑制剂(growth factor inhibitor) (8)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) 抗肿瘤药物药效学 包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验 评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。 体外抗肿瘤活性试验 试验目的 对候选化合物进行初步筛选 了解候选化合物的抗瘤谱 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 试验方法 选用10-15株人癌细胞株 根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养 推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。 试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。 测定细胞生长和存活方法 MTT法和XTT法是代谢测定法，没有颜色的tetrazolium salt (MTT 和XTT)被细胞还原，产生具有颜色的与活细胞数成比例的formazan， 比色测定。 为了简化MTT solubilization步骤，发展了XTT tetrazolium测定方法，MTT还原产生不溶性formazan ,比色测定前溶解于DMSO，XTT试剂可被活细胞直接代谢成水溶性formazan，不需进一步处理培养细胞，便可以立即读取光密度。方便简单，其缺点是可产生相对比较高的背景数据，同时也具有MTT的不稳定终点特性。 测定细胞生长和存活方法 对系列蛋白质染色剂进行实验，发现磺酰罗丹明B （sulforhodamine B）(SRB)可替代tetrazolium assay方法， 具有最好的燃料结合强度，信噪比率，并且和细胞数具有很好的线形关系，SRB是一亮粉色染料，在稀醋酸中，可结合于TCA固定细胞的碱性氨基酸上。具有十分稳定的终点 。 评价标准 以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线 采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。 体外试验至少重复一次。 体内抗肿瘤试验 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型 动物肿瘤移植模型 人类肿瘤裸鼠移植瘤模型 重复试验 鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型、原位接种模型和中空纤维测定(hollow-fiber assay)等 方法。 动物 动物要求健康，符合等级动物要求，有实验动物合格证。 雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同。 小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克。 评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠。 肿瘤模型 小鼠肿瘤模型 淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株等。 肿瘤模型 人类肿瘤裸鼠移植模型 应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人类肿瘤裸鼠移植试验。 人癌移植模型 优点 可预测细胞毒类化合物的活性 有助于筛选化合物，为临床用药程序和联合用药方案提供参考 可用于研究获得性药物抗性 人癌移植模型 人类肿瘤裸鼠移植模型建立时的注意点 人类肿瘤裸鼠移植模型建立时的注意点 细胞要求达到最低质量保证标准（支原体、MAP、人类同功酶、核型和体内致瘤性的检查）、适应同一培养液以及具有可重复的生长和药物敏感特性。制备大量的保种细胞，并冷冻保存，用于药物筛选过程中细胞经20代传代后的替换