菘蓝指纹图实验设计方案介绍.doc

菘蓝指纹图实验设计方案 水溶性成分的分析用高效液相色谱法 2.1实验材料：菘蓝的实生苗（根、茎、叶），组培苗（愈伤组织、不定芽） 2.2实验方法： 2.2.1 取新鲜的实验材料用蒸馏水洗干净放入烘干机里烘干，研成粉末。 2.2.2 粉末过40目筛，用电子分析天平精密称取样品1.0g，置50mL锥形瓶中， 加（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、水），超声提取1h。 2.2.3 离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，用旋转蒸发仪浓缩后 用20ml甲醇溶解。 2.2.4 于高效液相色谱仪中分析，进样前将样液用0.22μm的微孔滤膜过滤 液相色谱条件： 流速：0.3 ml/min、0.6ml/min、1.0 ml/min 2、进样量：5μl、10μl 3、用DAD进行全波长扫描（210~400nm） 4、柱温：25
℃ 5、(流动相：甲醇（A）：水（B）梯度洗脱 t/min 甲醇 水 0~5 90% 10% 5~20 80% 20% 20~45 75% 25% 45~65 10% 90% (流动相: pH6 .4，0.1mol/l的醋酸钠缓冲液( A )-乙腈 ( B ) , 梯度洗脱 t/min 0.1mol/l醋酸钠缓冲液 乙腈 0~5 97% 3% 5~45 95% 5% 45~55 70% 30% 55~65 60% 40% 氨基酸成分的分析用高效液相色谱法 2.1实验材料：菘蓝的实生苗（根、茎、叶），组培苗（愈伤组织、不定芽） 2.2实验方法： 2.2.1 取新鲜的实验材料用蒸馏水洗干净放入烘干机里烘干，研成粉末。 2.2.2 粉末过40目筛，用电子分析天平精密称取样品1.0g，置50mL锥形瓶中， 加（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、水），超声提取1h。 2.2.3 离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，用旋转蒸发仪浓缩后 用20ml甲醇溶解。 2.2.4 取上述样品2mL于10mL离心管中，加入衍生化试剂1mL，干燥试剂1mL， 旋涡混合1min，放置1h，加入正己烷4mL，旋涡混合1min，静置10min， 吸取下层溶液过0.22μm微孔滤膜，于高效液相色谱仪中分析。 2.3溶液的制备 2.3.1 样品溶液制备 配制0.1mol /L异硫氰酸苯酯( PITC) -乙腈溶液( 12:988) 适 量于棕色瓶中摇匀，作为衍生化试剂，需每日更换配制1.0mol /L三乙胺- 乙腈溶液( 139:861) 作为干燥试剂。 2.3.2 对照品衍生化溶液:分别精密称取Arg、Pro、Glu、Tyr各适量，根据各样 品含量，用（50%、100%）甲醇配制适宜的混合对照品溶液备用。精密吸 取混合对照品2mL于10mL离心管中，加入衍生化试剂1mL，干燥试剂 1mL，旋涡混合1min，放置1h，加入正己烷4mL，旋涡混合1min，静置 10min，吸取下层溶液过0.22μm微孔滤膜。 2.3.3 空白样品对照:精密吸取（50%、100%）甲醇2mL于10mL离心管中，加 入衍生化试剂1mL，干燥试剂1mL，旋涡混合1min，放置1h，加入正己 烷4mL，旋涡混合1min，静置10min，吸取下层溶液过0.22μm微孔滤膜。 液相色谱条件： 1、流速：0.3 ml/min、0.6ml/min、1.0 ml/min 2、进样量：5μl、10μl 3、用DAD进行全波长扫描（210~400nm） 4、柱温：25
℃ 5、流动相: pH6 .4，0.1mol/l的醋酸钠缓冲液( A )-乙腈 ( B ) , 梯度洗脱 t/min 0.1mol/l醋酸钠缓冲液 乙腈 0~5 97% 3% 5~45 95% 5% 45~55 70% 30% 55~65 60% 40% 挥发油的分析采用GC-MS联用技术 主要成分：十四酸（肉豆范酸)、十六酸（棕棕榈酸) 2.1实验材料：菘蓝的实生苗（根、茎、叶），组培苗（愈伤组织、不定芽） 2.2实验方法： 2.2.1 挥发油的提取： 2.2.1.1 水蒸气蒸馏法，1g板蓝根粉末约得2.5mg挥发油。 称取过40目筛的60 g的实验实生苗、组培苗粉末于圆底烧瓶中，加入180 mL 80℃的蒸馏水搅拌均匀，装好蒸馏装置，加热提取6 h，馏出物为水提取液。水提液用石油醚萃取，石油醚层用无水硫酸钠干燥（V/g=10:1），过滤得板蓝根挥发油-石油醚溶液，再用旋转蒸发仪旋干溶剂石油醚，挥发油。 粉末g 水ml 加热温度℃ 提取时间h 20 100 8