研究生实验细胞培养要点.ppt

吸去旧液 加入消化液 解离细胞约2min 在倒置显微镜下观 察，细胞呈圆粒状 细胞的传代培养：贴附型 PBS洗 涤 1~2次 吹打悬浮细胞 调整细胞密度 分装接种，置于CO2 培养箱中继续培养 在培养瓶中加入 适量含血清培养液 培养细胞 的观察 细胞的传代培养：贴附型 培养细胞 的观察 培养液颜色、是否清亮 培养细胞的状态 * * * * 组织培养和分子细胞学技术. 鄂征 主编.北京出版社, 1995年8月出版 细胞培养 司徒镇强 主编. 世界图书出版公司, 1996年出版 体外培养的原理和技术. 薛庆善 主编. 科学出版社, 2001年1月出版 动物细胞培养——基本技术指南(中译).章静波 等译. 科学出版社, 2004年10月出版. Human Cell Culture Protocols (2nd Ed). Joanna Picot. Humana Press, October 2004. Basic Cell Culture Protocols (3rd Ed). CD Helgason, CL Miller. Humana Press, October 2004 细胞培养技术主要参考资料 离心机 橱柜 实验台 冰箱 培养箱 试剂柜 实验仪器台 超净工作台 实验台 实验台 实验台 实验台 水池 冰箱 衣柜 实验台 显微镜 递物窗 缓冲间 无菌操作室 准备室 1.细胞培养室设置 细胞培养前的实验准备 下风口 上风口 无菌操作室 超净工作台和CO2培养箱 2.细胞培养的主要实验设备 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 ③箱内蒸馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。 解剖显微镜 倒置显微镜 2.细胞培养的主要实验设备 血清（天然成分）： 基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM 、α-MEM、RPMI1640 水：高纯度的去离子水 3.细胞培养的主要试剂（培养基） 抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/ml 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 血清的使用浓度为5％～20％ 消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁， 用含血清培养液中止其活性 4.细胞培养用器皿的清洗和消毒 ? 一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤： 1、自来水浸泡 2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理） 3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水） 4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用 常用消毒方法： 1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），15磅，15～20min 2、过滤除菌(如：血清的除菌） 细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来，置于培养皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的方法。 细胞培养 （Cell Culture） 细胞培养的基本概念 原代培养(primary culture)，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次培养，中途不分割培养物。常用的原代培养方法有组织块培养法和消化培养法。 原代培养 （Primary Culture） 细胞培养的基本概念 传代培养 （Secondly Culture） 传代培养(secondly culture)，在原代培养物铺展为单细胞层后，将原代培养细胞分开接种到两个或多个新的培养瓶中继续培养增殖。 细胞培养的基本概念 培养细胞的类型 贴附型 成纤维样细胞型 上皮样细胞型 悬浮型 细胞培养的基本概念 培养人真皮成纤维细胞 培养人口腔上皮细胞 培养的骨髓瘤细胞 贴附型细胞的生长特性 细胞的贴壁生长 接触抑制 细胞的生长曲线 细胞贴壁延展过程(模式图) 细胞培养的基本概念 细胞的接触抑制现象 正常培养细胞的生长曲线 退化死亡 平台期 细胞数增大极限点，出现接触抑制 细胞指数生长极限点 指数生长期 潜伏期 细胞数量 0 24 48 72 96 120 小时 指数生长期是最佳实验期 ! 实验准备 取材、分离细胞 原代培养 维护培养 小鼠胚胎成纤维细胞的