HPLC使用指南介绍.docVIP

HPLC使用指南 第一部分 使用前准备 1. 流动相 1.1? 常用的溶剂体系 1.1.1? 中性体系 甲醇-水 乙腈-水 异丙醇-水（质谱常用，HPLC使用较少） 1.1.2? 酸性体系 0.08% v/v TFA（三氟乙酸） in water - 0.08% v/v TFA in acetonitrile（乙腈） 0.1% v/v TFA in water - 0.1% v/v TFA in acetonitrile *HPLC常用的酸有：三氟乙酸，甲酸。 三氟乙酸：最常用。对体系（基线）的稳定性好。但配置好的流动相溶液不稳定，不能长时间放置。沸点低，容易除去。酸性较强。 甲酸：常用。沸点较低，较易除去。但对体系（基线）的稳定性较差。 **酸性体系会减少色谱柱的使用寿命。因此在使用不同的色谱柱之前，需要注意填料可耐受的酸碱度。一般C18的填料的耐受范围是pH3-8。 1.1.3? 缓冲体系 0.05M TEAB（?溴化四乙 - acetonitrile 0.1M TEAB - acetonitrile *HPLC常用的缓冲溶液体系有：三乙胺-碳酸缓冲液 TEAB ，三乙胺-醋酸缓冲液 TEAA ，三乙胺-磷酸缓冲液 TEAP 三乙胺-碳酸缓冲液 TEAB ：沸点较低，容易除去。常用。 三乙胺-醋酸缓冲液 TEAA ：沸点较高，不易除去。多用TEAB替代。 三乙胺-磷酸缓冲液 TEAP ：根据需要使用。 **摩尔浓度指TEA的摩尔浓度，酸用来调节pH值。根据需要调节所需要的pH值。例如：pH7.5的TEAB 0.05M 水溶液。 1.2? 溶剂过滤及过滤设备 1.2.1? 溶剂过滤 必须过滤的流动相：经过配置的酸性体系及缓冲体系 可以不过滤的流动相：中性体系，即纯水，纯乙腈，纯甲醇 *所有接触过非色谱纯的容器的溶液，都需要过滤。过滤之后需要用标签注明过滤的日期。 **已过滤的溶液，经过长时间放置，需要重新过滤。 1.2.2? 溶剂过滤器 *由过滤杯，过滤头，接收瓶及铝合金夹子组成。铝合金夹子可以固定过滤杯及过滤头，不能固定接收瓶，因此在拿放溶剂过滤器的时候要握紧接收瓶。 **使用过滤器后，需注明过滤头中的滤膜是水相还是有机相。 1.2.3? 滤膜 50mm, 0.45um水相滤膜过滤水用 50mm, 0.45um有机相滤膜过滤有机溶剂用 *两者不可混用，当过滤一种溶剂之后，必须将过滤头内的溶剂抽干，再换不同种类的滤膜，否则会导致滤膜溶解进入过滤头。如果发生滤膜溶解的情况，比如过滤水相之后没有将过滤头内的水抽干就直接放入有机相滤膜，此时滤膜非常容易被溶解，需要用水大量冲洗过滤头及接收瓶。反之亦然。 1.2.4? 排气 无论流动相时候过滤过，在使用之前均需要超声排气。排气时间以不超过10min为宜，且温度较低为宜。因为超声时间过长会使温度升高，气体会重新溶解进入流动相。 2. 仪器 开机顺序：泵 → 紫外检测器 → 电脑 → 工作站 → 软件 2.1? 泵 2.1.1? 控制模式 内控：由控制面板控制。外控指示灯灭。只能设置恒定梯度。 外控：由电脑通过工作站控制。外控指示灯亮或闪烁（闪烁为暂停状态）。可以设置线性梯度。 *通过menu 2转换控制模式 2.1.2? 冲洗 冲洗前需先开启空气阀。 冲洗可以快速替换体系内的溶剂，排除体系内的空气。 关闭冲洗后关闭空气阀。 *当沉子内没有液体时，冲洗时可能不易吸上液体。此时可以打开空气阀，用针管从空气阀抽出空气，可以快速吸出液体。 2.2? 管路系统 泵之后的管路的冲洗： 可以将色谱柱的位置接上两通，加大流速（每一个泵的流速可以设置到3ml/min）冲洗。主要冲洗六通阀（此时应在inject状态）及检测池内的管路。 2.3? 紫外检测器 2.3.1? 分类 分析型与半制备型紫外检测器不可混用。 在使用半制备紫外检测器时，流出口需要有反压装置。 冲洗管路之后，可以将紫外检测器拆下，对光查看石英孔里是否还有气泡。 2.3.2? 预热 紫外检测器需要预热，即至少开机15min之后才可进样。此时一般为平衡柱子的时间，所以一般不需特意预热紫外灯。 2.3.3? 设置 常用的波长有214nm，220nm，254nm，260nm，280nm。根据需要选择所需要的波长。除三乙胺之外，流动相溶液的截止波长都比较低，不会对末端吸收产生影响。 *截止波长：三氟乙酸 210nm ，甲醇 205nm ，水 200nm ，乙腈 190nm 。 波长较长的波段是钨灯范围，但是用较少。 2.3.4? 保护 氘灯和钨灯均有一定的使用寿命，长时间不用请关闭。但开关一次紫外灯相当于损耗3小时的使用寿命。因此间隔小于4小时不需要关闭紫外灯。 *可以通过操作菜单中m